Alzheimer病星形膠質(zhì)細(xì)胞和海馬神經(jīng)元胰島素信號(hào)通路蛋白變化的研究.pdf

1、研究背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，也是老年人癡呆中最常見(jiàn)的類(lèi)型，表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)精神癥狀及生活能力的逐漸喪失。該病發(fā)病率高，是繼心腦血管疾病和腫瘤之后導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因，正日益成為對(duì)老年人健康的重要威脅。AD是一種多因素共同作用而致的復(fù)雜異質(zhì)性疾病，淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)沉積、神經(jīng)存活通路紊亂、糖代謝障礙、

2、線粒體損傷、氧化應(yīng)激和炎癥等均參與疾病的發(fā)生發(fā)展。其中，Aβ沉積是公認(rèn)的“源頭”，尤其以Aβ1-42寡聚體毒性最強(qiáng)，而其他的病理改變和致病途徑可能是Aβ過(guò)量沉積的繼發(fā)結(jié)果。
　　胰島素信號(hào)通路參與能量代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌兩個(gè)過(guò)程，能調(diào)節(jié)糖脂代謝、突觸形成及重塑、細(xì)胞存活和生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)、線粒體功能和學(xué)習(xí)記憶等。該通路破壞不僅與糖尿病和肥胖等疾病相關(guān)，而且與神經(jīng)退行性變及認(rèn)知功能下降密不可分，且已經(jīng)證實(shí)該通路損傷后能增加癡呆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

3、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是蛋白激酶B(protein kinase B，Akt/PKB)的下游底物之一，并且能調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。兩者還能通過(guò)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)及記憶形成。因此，增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路的活性能起到神經(jīng)保護(hù)及改善認(rèn)知的作用。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織的支持細(xì)胞，為神經(jīng)元提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。具體而言，星形膠質(zhì)細(xì)胞能維持突觸的正常功能、轉(zhuǎn)

4、移和儲(chǔ)藏信息、參與認(rèn)知、產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子、移除毒素和代謝產(chǎn)物、維持正常的氧化還原電勢(shì)以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和離子的濃度等。最重要的是，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)有大量胰島素受體(insulin receptor，IR)，并能受胰島素的影響。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)和記憶中起舉足輕重的作用。谷氨酸在神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)釋放到突觸間隙中，然后被星形膠質(zhì)細(xì)胞上的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（exc

5、itatory amino acid transporters，EAATs）快速重吸收。該轉(zhuǎn)運(yùn)體被破壞的直接后果是導(dǎo)致谷氨酸在細(xì)胞外過(guò)度蓄積而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性損傷，而這也是多種神經(jīng)退行性疾病包括AD的發(fā)病機(jī)制之一。
　　研究目的:
　　觀察Aβ1-42寡聚體對(duì)人星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，探索人星形膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在insulin/Akt/EAAT通路，以及Aβ1-42寡聚體和胰島素對(duì)該通路蛋白表達(dá)水平和活性的影響作用;同時(shí)還

6、觀察Aβ1-42寡聚體側(cè)腦室灌注AD模型大鼠的行為學(xué)改變及海馬神經(jīng)元胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;進(jìn)一步尋找AD的發(fā)病機(jī)制及有效的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.Aβ1-42寡聚體的制備和鑒定。我們分別使用基礎(chǔ)的方法和改良的方法制備Aβ1-42寡聚體，后者能在短時(shí)期內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定保存。具體而言，首先，將Aβ1-42凍干粉與室溫平衡后加入六氟異丙醇（hexafluoro-isopropanol，HFIP）使其單體化，再

7、用無(wú)水二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解Aβ1-42肽膜。然后，使用SDS-PBS重懸Aβ-DMSO溶液并于4℃孵育24h。最后，用PBS稀釋重懸液，再于4℃孵育2周后用不含血清的DMEM稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的濃度。Aβ1-42寡聚體制備完成后在透射電鏡下進(jìn)行觀察和鑒定。
　　2.細(xì)胞分組和藥物干預(yù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞共分為6組，待饑餓處理結(jié)束后即加藥。C組為空白對(duì)照組，即給予無(wú)胎牛血清(fetal bovine

8、 serum，F(xiàn)BS)的DMEM;Ⅰ組給予100nmol/L的Aβ1-42寡聚體溶液;Ⅱ組給予1μmol/L的Aβ1-42寡聚體溶液。將三組細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、5％CO2含量的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。后三組是在前三組的基礎(chǔ)上均再給予100nmol/L人合成胰島素作用30min，即Ⅲ組為給予無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)24h后再給予100nmol/L胰島素作用30min;Ⅳ組為給予100nmol/L的Aβ1-42寡聚體溶液培養(yǎng)24h后

9、再給予100nmol/L胰島素作用30min;Ⅴ組為給予1μmol/L的Aβ1-42寡聚體溶液培養(yǎng)24h后再給予100nmol/L胰島素作用30min。
　　3.觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)及檢測(cè)insulin/Akt/EAAT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。首先，用熒光定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的mRNA和蛋白水平，再通過(guò)免

10、疫熒光染色的方法觀察細(xì)胞形態(tài)變化。然后，使用熒光定量RT-PCR檢測(cè)IR、Akt、mTOR、EAAT1和EAAT2的mRNA水平;使用Western blot的方法檢測(cè)IR-α、IR-β、磷酸化胰島素受體(phosphorylation of insulin receptor，p-IR，Y1361)、Akt、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B，p-Akt，S473)、mTOR、磷酸化

11、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylation of mammalian target of rapamycin，p-mTOR，S2448)、EAAT1和EAAT2的蛋白水平;使用免疫熒光染色的方法進(jìn)一步觀察IR-α、IR-β和p-IR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
　　4.星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的檢測(cè)。使用MTT的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ1-42寡聚體和胰島素作用下細(xì)胞活性的變化。
　　5.動(dòng)物分組和AD動(dòng)物模型的建立。3-

12、4月齡的健康成年雄性Wistar大鼠50只，體重為225±25g。術(shù)前行為學(xué)檢測(cè)淘汰5只，將剩余45只大鼠分為3組。即正常對(duì)照組（C組，大鼠僅行手術(shù)而未行任何注射）、生理鹽水組(NS組，向大鼠側(cè)腦室內(nèi)緩慢持續(xù)泵入生理鹽水)和Aβ1-42寡聚體注射組(AD組，向大鼠側(cè)腦室內(nèi)緩慢持續(xù)泵入Aβ1-42寡聚體)，各組動(dòng)物數(shù)量均為15只(n=15)。先將Aβ1-42寡聚體溶液或者生理鹽水注滿微滲泵后再把各部分裝置組裝起來(lái)，并在腦立體定位儀的作用下

13、植入微滲泵。調(diào)節(jié)流量調(diào)節(jié)器，使Aβ1-42寡聚體溶液或者生理鹽水緩慢持續(xù)泵入，每天泵入3μL，連續(xù)給藥30天。所有操作均遵循無(wú)菌操作的原則。術(shù)后待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，并常規(guī)給予肌肉注射青霉素8萬(wàn)單位以防止切口感染，連續(xù)給藥3天。
　　6.行為學(xué)檢測(cè)。給藥結(jié)束后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。術(shù)后第31-34天進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，第35天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將平臺(tái)置于南象限（隨機(jī)預(yù)設(shè)），記錄分析每只大鼠的逃避潛

14、伏期，即在定向航行實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間;記錄分析空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)原位置的次數(shù);記錄分析空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠在南象限停留的時(shí)間;記錄分析空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠在南象限游動(dòng)的路程;計(jì)算空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠在南象限游動(dòng)的時(shí)間及路程占總時(shí)間和總路程的比率。
　　7.大鼠海馬神經(jīng)元胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。麻醉大鼠，取材、固定海馬組織后行免疫組織化學(xué)染色觀察IR、胰島素受體底物-1(insulin receptor subst

15、rate，IRS-1)、Akt、B淋巴細(xì)胞瘤/白血病基因-2(B celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)的表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0或SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析的結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組之間的差異采用單因素方差分析（anal

16、ysis of variance，ANOVA）進(jìn)行比較，兩組之間的差異用Tukey's檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.Aβ1-42寡聚體的鑒定結(jié)果:在透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Aβ1-42寡聚體形態(tài)比較一致，大小比較均勻，呈規(guī)則的球形或橢球形，直徑為12-25nm，且未在寡聚體溶液中檢測(cè)到纖絲狀物質(zhì)形成。
　　2.星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ1-42寡聚體的反應(yīng):GFAP的mRNA水平和蛋

17、白水平在Aβ1-42寡聚體的作用下均升高(p＜0.05)，且兩者均與Aβ1-42寡聚體的濃度呈劑量依賴(lài)性;形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞呈反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為胞體和胞核均增大，突起肥大，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯改變。
　　3.星形膠質(zhì)細(xì)胞insulin/Akt/EAAT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及活性檢測(cè)結(jié)果:①Aβ1-42寡聚體降低星形膠質(zhì)細(xì)胞IR的mRNA水平(p＜0.05)，胰島素對(duì)此無(wú)影響(p＞0.05);隨Aβ1-42寡聚體濃度升高，IR-

18、α、IR-β和p-IR的表達(dá)均逐漸減少，而胰島素能逆轉(zhuǎn)這三種蛋白下降的趨勢(shì)(p＜0.05)。②Akt的mRNA水平和總蛋白水平均不受Aβ1-42寡聚體和胰島素影響(p＞0.05);隨Aβ1-42寡聚體濃度升高，p-Akt表達(dá)減低，而胰島素則能增加p-Akt的水平(p＜0.05)。③在Aβ1-42寡聚體和胰島素的作用下，mTOR的mRNA和總蛋白水平均未改變(p＞0.05);而p-mTOR的表達(dá)隨Aβ1-42寡聚體濃度升高而降低(p＜0.

19、05)，胰島素能逆轉(zhuǎn)減少的p-mTOR(p＜0.05)。④在Aβ1-42寡聚體和胰島素作用下，EAAT1和EAAT2的mRNA水平保持不變(p＞0.05);而在Aβ1-42寡聚體作用下，EAAT1和EAAT2的總蛋白水平下降(p＜0.05);在胰島素的刺激下，與相應(yīng)對(duì)照組相比，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的EAAT1和EAAT2的蛋白水平均增加(p＜0.05)。
　　4.星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的測(cè)定結(jié)果:Aβ1-42寡聚體在濃度為100nmol/L

20、和1μmol/L時(shí)都能導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性下降(p＜0.05)。而與對(duì)照組相比，胰島素的刺激則能增強(qiáng)細(xì)胞的活性(p＜0.05)。
　　5.動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)估結(jié)果:定向航行實(shí)驗(yàn)中大鼠的逃避潛伏期能反應(yīng)其學(xué)習(xí)能力，而空間探索實(shí)驗(yàn)中大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)所在位置的次數(shù)、尋找平臺(tái)的時(shí)間比例和路程比例則能反應(yīng)其記憶能力。①AD組大鼠逃避潛伏期為87.40±6.70s，比NS組(15.23±4.65s，p＜0.05)和C組（14.00±6.01s，p＜

21、0.05）均明顯延長(zhǎng)，NS組與C組的逃避潛伏期無(wú)明顯差異(p＞0.05)。②AD組大鼠經(jīng)過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)比NS組和C組明顯減少(p＜0.05)。③AD組大鼠尋找平臺(tái)所在位置的時(shí)間比例（AD組vs.NS組是0.24±0.09svs.0.34±0.07s，p＜0.05;AD組vs.C組是0.24±0.09svs.0.35±0.01s，p＜0.05）和路程比例（AD組vs.NS組是0.27±0.05vs.0.35±0.03，p＜0.05

22、;AD組vs.C組是0.27±0.05vs.0.35±0.06，p＜0.05）也均要比NS組和C組顯著減少;而在NS組和C組中，大鼠尋找平臺(tái)所用的時(shí)間比例和路程比例也均無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　6.大鼠海馬神經(jīng)元胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果:①Aβ1-42寡聚體降低海馬神經(jīng)元IR的表達(dá)(AD組vs.NS組是0.25±0.02vs.0.38±0.03，p＜0.05;AD組vs.C組是0.25±0.02vs.0.40±0.

23、02，p＜0.05)。②IRS-1在AD組的表達(dá)水平明顯比NS組和C組低（AD組vs.NS組是0.22±0.02vs.0.35±0.03，p＜0.05;AD組vs.C組是0.22±0.02vs.0.29±0.06，p＜0.05），而NS組與C組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。③Akt在AD組的表達(dá)水平比NS組(0.20±0.03vs.0.37±0.03，p＜0.05)和C組（0.20±0.03vs.0.38±0.03，p＜0.05）

24、均減少，在NS組與C組無(wú)差異(p＞0.05)。④Aβ1-42寡聚體使Bcl-2表達(dá)降低（AD組vs.NS組是0.20±0.02vs.0.41±0.04，p＜0.05;AD組vs.C組是0.20±0.02vs.0.40±0.06，p＜0.05）。⑤AD組大鼠海馬神經(jīng)元CREB的表達(dá)與NS組（AD組vs.NS組是0.43±0.03vs.0.40±0.03）和C組（AD組vs.C組是0.43±0.03vs.0.41±0.03）相比無(wú)明顯差異(

25、p＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.采用改良的方法制備Aβ1-42寡聚體能穩(wěn)定儲(chǔ)存，透射電鏡鑒定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于AD模型的制備。
　　2.Aβ1-42寡聚體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均能造成毒性損害，側(cè)腦室持續(xù)微量泵入Aβ1-42寡聚體的大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　3.星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在insulin/Akt/EAAT通路，且Aβ1-42寡聚體在濃度為100nmol/L時(shí)就能使該信號(hào)通路相關(guān)底物表達(dá)