四種不同種屬鼠的皮膚黑色素分布及α-MSH表達(dá)研究.pdf

1、一、目的與意義： 色素代謝障礙性疾病(如黃褐斑、白癜風(fēng))，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，臨床缺乏理想療效的關(guān)鍵是有關(guān)色素調(diào)節(jié)的影響因素、作用機(jī)理與規(guī)律未能得到深入的科學(xué)闡述；而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則是醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)與條件，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更是醫(yī)學(xué)研究的重要載體和手段。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者已展開(kāi)對(duì)色素代謝障礙性疾病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，但大多數(shù)報(bào)道的是某一疾病動(dòng)物模型的建造方法或藥物對(duì)酪氨酸酶活性與黑素細(xì)胞增殖或抑制作用的影響，而不同觀察指標(biāo)與適宜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2、的選擇問(wèn)題及更深入的研究還是欠缺。 事實(shí)上，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、品系等的不同，其解剖、生理、病理、遺傳傾向及實(shí)驗(yàn)敏感性等生物學(xué)特性亦有所差異，會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成功與否具有不同程度的影響。究竟哪種動(dòng)物是色素代謝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷睦硐脒x擇，依據(jù)是什么? 目前研究認(rèn)為，色素代謝障礙性疾病主要是皮膚黑素代謝障礙所引起的，而黑素主要由黑素細(xì)胞分泌。黑素細(xì)胞含有黑素生成酶(酪氨酸酶)，在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸逐漸被氧化，接著重新排列并聚合，

3、最后與蛋白質(zhì)結(jié)合為黑素蛋白。因此，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究多針對(duì)酪氨酸酶活性對(duì)黑素細(xì)胞增殖或抑制作用的影響。最近研究證實(shí)，表皮細(xì)胞中黑素細(xì)胞能產(chǎn)生和分解阿黑皮素原，生成a-黑素細(xì)胞刺激素(a-melanocyte-stimulatinghormone，a-MSH)，再與黑皮素-1(MC1R)受體結(jié)合，激活腺甘酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，進(jìn)而激活cAMP倚賴蛋白激酶，促進(jìn)酪氨酸酶的合成及表達(dá)，促進(jìn)黑素細(xì)胞有絲分裂，使黑素細(xì)胞快速

4、增值，促進(jìn)黑素合成。因此，a-MSH也對(duì)黑素生成具有重要意義。 為了能夠進(jìn)一步說(shuō)明色素代謝障礙性疾病實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物選擇問(wèn)題，并能夠深入探討黑素細(xì)胞刺激素可能的影響機(jī)制，我們對(duì)SPF級(jí)雌性昆明種小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黃色HARTLY豚鼠四種常用于色素病實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物進(jìn)行了有關(guān)皮膚表皮黑色素分布及a-MSH表達(dá)情況的對(duì)比觀察研究，以期為選擇合理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及深入探討黑素細(xì)胞刺激素的影響機(jī)制提供必要的理論

5、和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、方法與內(nèi)容： 購(gòu)進(jìn)正常的SPF級(jí)雌性昆明種小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黃色HARTLY豚鼠各12只，各組小鼠預(yù)養(yǎng)3天，正常喂養(yǎng)1周后，于第8天上午將各組動(dòng)物用3％戊巴比妥45mg/Kg腹腔麻醉后，作常規(guī)固定，刮除背部皮膚表面毛發(fā)，用組織剪剪取2cm×2cm大小皮膚數(shù)塊，10％中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片備用； 1、四種不同種屬鼠的皮膚表皮黑色素分布情況的觀察研究

6、隨機(jī)在每組選擇相同數(shù)量的標(biāo)本，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用MouseAnti-HumanMelanomaMonoclonalAntibody為第一抗體，以免疫組織化學(xué)方法(具體操作按相關(guān)試劑盒說(shuō)明)顯示表皮中的黑色素顆粒，用緩沖液替代第一抗體做陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，在200倍顯微鏡下觀察黑色素陽(yáng)性細(xì)胞在表皮中的分布情況，并進(jìn)一步用Imagetools3.0圖像分析軟件分析細(xì)胞平均截面積和灰度值。 2、四種不同種屬鼠的

7、皮膚表皮a-MSH表達(dá)情況的觀察研究 隨機(jī)在每組選擇相同數(shù)量的標(biāo)本，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(S-P)常規(guī)染色法檢測(cè)a-MSH在表皮的陽(yáng)性表達(dá)情況，用緩沖液替代第一抗體做陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。然后將標(biāo)本均用200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)視野觀察表皮a-MSH陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，并由JVC彩色攝像頭將細(xì)胞圖像輸入Mias系統(tǒng)拍照。 最后采用相應(yīng)的計(jì)分方法，分別對(duì)動(dòng)物皮膚表皮表

8、皮黑色素及a-MSH陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)分，并應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以分析，均以a=0.05，P<0.05時(shí)判為有顯著性差異； 三、結(jié)果： 1、四種不同種屬鼠的皮膚表皮黑色素分布情況的觀察結(jié)果 在SPF級(jí)雌性昆明種小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的黑色素顆粒，C57BL/6J小黑鼠可見(jiàn)黑色素顆粒成簇分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，在表皮中幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的黑色素顆粒，棕黃色HAR

9、TLY豚鼠基底層細(xì)胞間及毛囊中均可見(jiàn)黑色素顆粒陽(yáng)性反應(yīng)的黑素細(xì)胞，中間層的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)有時(shí)可見(jiàn)少量被吞噬的淡染的黑色素顆粒存在；棕黃色HARTLY豚鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均優(yōu)于其他三組動(dòng)物(P<0.01)；C57BL/6J小黑鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均優(yōu)兩組白色動(dòng)物(P<0.01)；兩組白色動(dòng)物陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均無(wú)明顯差異(P>0.05)。 2、四種不同種屬鼠的皮膚表皮a-MSH表達(dá)情況的觀察結(jié)果

10、在SPF級(jí)雌性昆明種小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的a-MSH細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)率均為0.00％，C57BL/6J小黑鼠可見(jiàn)a-MSH分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，在表皮中幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的a-MSH細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)率為20.00％，棕黃色HARTLY豚鼠基底層細(xì)胞間及毛囊中均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的a-MSH，在表皮黑素細(xì)胞的胞漿或細(xì)胞外基質(zhì)，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布陽(yáng)性表達(dá)率為55.00％。且a-MSH在C57BL

11、/6J小黑鼠毛囊黑素細(xì)胞及棕黃色HARTLY豚鼠表皮黑素細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)。 四、結(jié)論： 1、白色昆明雌性小鼠及白色FMN雌性豚鼠不適宜用作觀測(cè)皮膚表皮及毛囊黑色素或a-MSH變化情況的實(shí)驗(yàn)研究，可考慮用于色素增加性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图八幬锏难芯浚?2、C57BL/6J小黑鼠適宜用作色素代謝障礙性皮膚疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但僅適宜用于觀測(cè)毛囊a-MSH變化情況的實(shí)驗(yàn)研究： 3、棕黃色HARTLY豚

12、鼠則適宜用做觀察皮膚表皮及毛囊的黑色素或a-MSH變化情況的實(shí)驗(yàn)研究； 4、棕黃色HARTLY豚鼠的表皮及毛囊黑色素細(xì)胞分泌黑色素的能力優(yōu)于C57BL/6J小黑鼠的表皮及毛囊黑色素細(xì)胞，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此棕黃色HARTLY豚鼠比C57BL/6J小黑鼠更適宜用于色素代謝障礙性皮膚疾病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究； 5、本實(shí)驗(yàn)提示我們，目前已初步具備了對(duì)a-MSH進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)條件，由于a-MSH在黑色素代謝過(guò)程中的調(diào)控作用較酪氨酸酶更為細(xì)