同源異型盒基因與血管瘤發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 嬰幼兒血管瘤(簡(jiǎn)稱(chēng)血管瘤)是小兒最常見(jiàn)的良性腫瘤，其特點(diǎn)為生后早期出現(xiàn)并快速增長(zhǎng)，隨后出現(xiàn)自發(fā)而緩慢的消退。雖然大多數(shù)血管瘤會(huì)自行消退，但部分病例中快速生長(zhǎng)的瘤體可能損害重要臟器組織功能甚至危及生命，并影響外觀。對(duì)于這部分病例往往臨床處理困難，究其原因，是由于目前對(duì)血管瘤增殖和消退的病理發(fā)生機(jī)制不明確。 同源異型盒基因編碼一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子都包含一段長(zhǎng)61個(gè)氨基酸被稱(chēng)為同源結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合

2、序列，可以調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和遷移，在胚胎發(fā)育和器官形成以及成體腫瘤發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此同源異型盒基因可能在生理和病理狀態(tài)下的血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。最近的一些研究表明同源異型盒基因和導(dǎo)致血管成形術(shù)后再狹窄的血管細(xì)胞表型改變、血管生成和淋巴管生成有關(guān)。 因此，同源異型盒基因可能在血管瘤發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)異?？赡苁窃斐裳芰霭l(fā)病的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)擬采用基因芯片篩選和血管瘤發(fā)病相關(guān)的同源

3、異型盒基因，然后對(duì)他們?cè)谘芰鼋M織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，并觀察人為干預(yù)其表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化，以了解這些基因的可能作用機(jī)制。 方法 (1)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(血管瘤增殖期)與對(duì)照組(血管瘤消退期)各3例，均為在四川大學(xué)華西醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的住院患者，診斷均經(jīng)臨床及病理學(xué)診斷證實(shí)。術(shù)中取血管瘤瘤體組織，分為兩份，快速液氮保存，一份用于基因芯片研究，另一份用于HE染色。常規(guī)法抽提血管瘤組織總RNA，純化mRNA，用232種

4、人類(lèi)同源異型盒基因Oligo探針制成基因芯片，將等量的兩組骨骼肌組織mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光標(biāo)記的cDNA混合物探針，與上述基因芯片雜交，經(jīng)嚴(yán)格洗片后，用掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖像，計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到二者間基因表達(dá)的差異信息。 (2)選取10例增殖期血管瘤、3例消退期血管瘤和11例血管畸形標(biāo)本，均來(lái)至四川大學(xué)華西醫(yī)院和華西口腔醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的住院患者，診斷均經(jīng)臨床及病理證實(shí)。采用同樣的方法提取標(biāo)本中的

5、RNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)HOXC6在這些組織中的表達(dá)水平，并用比較閾值法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 (3)設(shè)計(jì)、化學(xué)合成3條HOXC6特異性siRNA。體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，以200nM siRNA用Oligo．fectamine<'TM>Reagent轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞內(nèi)HOXC6 mRNA表達(dá)，篩選出抑制效率最高的siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。選用抑制效率最高的siRN

6、A分別以50，100，150，200nM siRNA轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)siRNA干擾后血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期變化情況，并檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果 (1)通過(guò)基因芯片篩選，在232種同源異型盒基因中獲得與血管瘤可能相關(guān)的25條基因，其中在增殖期血管瘤組織中20條基因表達(dá)上調(diào)，5條基因表達(dá)下調(diào)。 (2)血管瘤增殖期HOXC6的表達(dá)明顯高于血管瘤消退期和血管畸形組織；而HOXC6在后兩者之

7、間的表達(dá)沒(méi)有明顯區(qū)別。 (3)化學(xué)合成的HOXC6特異性siRNA能夠抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304內(nèi)HOXC6表達(dá)，其沉默效應(yīng)具有高效性。HOXC6 siRNA轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后72小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞活力下降，并呈一定的濃度依賴(lài)性。細(xì)胞周期分析顯示HOXC6 siRNA將部分細(xì)胞阻滯在G<,1>／G<,o>期。Annexin V／PI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)HOXC6siRNA處理的ECV304組織細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯變化。