土壤中蘇云金桿菌HBF-1菌株毒蛋白ELISA檢測方法的建立及應用.pdf

1、本文以在我國分離獲得的對麗金龜科幼蟲高毒力的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis簡稱Bt)HBF-1為供試菌株，以其產生的殺蟲晶體蛋白為檢測目標，通過制備的抗Bt蛋白多克隆抗體，建立了土壤中HBF-1菌株毒蛋白含量的酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定方法。 抗原是影響抗體特異性和效價的重要因素。為了得到高純度的殺蟲晶體蛋白，本研究采用等電點

2、法沉淀出晶體殺蟲蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步純化粗提的殺蟲晶體蛋白，得到分子量約為130kDa的電泳純殺蟲晶體蛋白，作為免疫用抗原。利用該抗原分四次對新西蘭白兔進行免疫，獲得了高特異性的抗血清，再用辛酸一硫酸銨鹽析法，獲得了高免血清中的免疫球蛋白IgG，SDS-PAGE電泳結果表明，提取的IgG純度較高，其濃度達到5.6344mg/mL。采用改良的過碘酸鈉法，用辣根過氧化物酶標記IgG，制備出標記率為0.28，克分子比為0.798的

3、酶標抗體。 通過利用直接法、間接法和雙抗夾心法等ELISA方法檢測土壤中Bt毒蛋白的含量，綜合樣品檢測值的相關系數(shù)CV，EC<,50>及檢測率三個方面，明確雙抗體夾心ELISA法均優(yōu)于其它兩種方法，間接ELISA法次之，從而證明雙抗夾心法是一種檢測土壤中Bt毒蛋白含量較適宜的方法。明確了雙抗體夾心ELISA法的最佳工作條件：抗體的包被量為7μg/mL；Bt殺蟲晶體蛋白的3種提取液(Tris-硼酸、Na<,2>CO<,3>緩沖液、

4、PBST)中，以Na<,2>CO<,3>緩沖液為最佳提取液；封閉液為0.1％明膠-PBST；酶標抗體的最適工作濃度為1：800稀釋；待測樣品的反應時間為37℃ 120min；酶標抗體的時間為37℃ 60min底物顯色時間為室溫15min。通過對該ELISA法的特異性試驗、交叉性試驗和重復性試驗驗證，證明雙抗體夾心ELISA法是一種特異、敏感、快速、操作簡便的方法。 利用優(yōu)化的雙抗夾心ELISA系統(tǒng)檢測花生田里Bt蛋白的消長動態(tài)，

5、結果表明利用雙抗夾心ELISA法定量測定土壤中Bt蛋白的量能夠明確反映出土壤中Bt毒蛋白含量的動態(tài)變化情況。在播種期施入Bt毒蛋白，原液及2倍稀釋液土深20cm的處理在3d時達到最大含量，隨后為平緩下降的趨勢；原液和2倍稀釋液土深2cm的處理在3d時蛋白含量上升，隨后下降，在21d時檢測量達到最高峰，隨后下降至134d檢測結束，在此過程中3～14d深土層20cm的蛋白含量明顯高于淺土層2cm，隨后除2倍稀釋液21d、31d時有所例外，其

6、余各處理均為深土層蛋白量高于淺土層。在開花前期施入Bt毒蛋白，四處理的蛋白含量3d達到最高，隨后原液和2倍稀釋液土深20cm的處理急劇下降，原液和2倍稀釋液土深2cm的處理下降平緩。在開花后期施入Bt毒蛋白，四處理蛋白含量3～7d達到最高，隨后呈平緩下降的趨勢。因此，在不同施藥時期，各處理深土層20cm的Bt蛋白量高于淺土層2cm?？傊?，在花生開花前期和開花后期進行灌根施藥，土壤中Bt蛋白表達高峰期即為銅綠麗金龜(Anomala cor