重組TrxTSHRn蛋白的鑒定、檢測TRAb ELISA的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、人促甲狀腺素受體(hTSHR)是一種膜蛋白，主要存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞(TEC)膜上，近年發(fā)現(xiàn)也存在于其他細(xì)胞上，如淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞等。生理情況下，hTSHR與促甲狀腺素(TSH)結(jié)合，調(diào)節(jié)甲狀腺濾泡細(xì)胞的正常功能和生長。遺傳和環(huán)境作用下，hTSHR結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，產(chǎn)生了抗原性，引起自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)。此時體內(nèi)出現(xiàn)TSHR抗體(TRAb)，TRAb為多克隆抗體，根據(jù)其與hTSHR結(jié)合后的效應(yīng)不同分

2、為甲狀腺刺激性抗體(TSAb)和阻滯性抗體(TSBAb)。檢測體內(nèi)的TRAb對AITD的診斷、治療及預(yù)后評價均有重要意義。hTSHR為G蛋白偶聯(lián)的大分子糖蛋白，分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)三部分。膜外區(qū)有418個氨基酸，其中有9個亮氨酸富含區(qū)、一個N末端和一個信號肽，前21個氨基酸為信號肽呈疏水性，但整個膜外區(qū)呈親水性，主要作用為與配體結(jié)合活化受體。TRAb抗原決定簇主要存在膜外區(qū)，TSAb的抗原決定簇主要位于TSHR-ecdN-端，而T

3、SBAb的抗原決定簇主要位于TSHR-ecdC-端?？缒^(qū)有264個氨基酸，呈疏水性，有七個跨膜段，膜外3個環(huán)和膜內(nèi)3個環(huán)。膜內(nèi)區(qū)有82個氨基酸，有一個C端和C激酶磷酸化位點?？缒^(qū)和膜內(nèi)區(qū)主要作用為輔助受體的活化、傳遞活化信號及與G蛋白結(jié)合而啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。 目的由于TSHR抗原決定簇主要集中在膜外區(qū)(TSHR-ecd)，且目前大量的研究已確定TSHR-ecd氨基端是TSAb的重要靶區(qū)。本研究在對大腸桿菌E.coliB

4、L21StarTM(DE3)中表達(dá)的硫氧還蛋白融合的TSHR-ecd氨基端蛋白(TrxTSHRn)，進(jìn)行分子量鑒定和Westernblot鑒定，以此蛋白為抗原建立TRAb的ELISA檢測方法并初步應(yīng)用于臨床。 方法1.蛋白的鑒定取本室研制的重組TrxTSHRn蛋白。應(yīng)用SDS-PAGE對蛋白進(jìn)行分子量鑒定，SDS-PAGE電泳后，通過轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合一抗、結(jié)合二抗及顯色，對此蛋白行Westernblot以鑒定其免疫活性。

5、 2.TRAb的ELISA檢測方法的建立及初步臨床應(yīng)用以融合蛋白TrxTSHRn為抗原，通過不同的抗原包被量、不同的血清稀釋度優(yōu)化，建立TRAb的間接ELISA檢測方法。以此方法檢測初發(fā)Graves'病人、治療中Graves'病人、Hashimoto甲狀腺炎病人、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病人血清中TSAb。 結(jié)果1.使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得重組TrxTSHRn蛋白分子量為35.9kD，與理論計算值34.4kD相差4.36％。

6、 2.Westernblot顯示在35KD處陽性血清可見染色條帶，陰性對照血清對應(yīng)處無染色條帶。該蛋白存在免疫活性。 3.抗原包被量10ng/100μl、待測血清稀釋200倍時陽性和陰性血清OD405分別為1.002和0.459，批內(nèi)變異為3.8％和3.6％，批間變異為5.15％和3.93％，正常人中OD405值為0.46±0.15，正常值范圍為0.46±0.3，初發(fā)Graves'病人陽性率為70.4％，抗甲狀腺治療3個月