周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細胞亞群與腫瘤干細胞相關(guān)性的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討通過誘導(dǎo)靜止期腫瘤細胞進入細胞周期，增強腫瘤對化療藥物敏感性的可行性及其作用機制。
　　 材料和方法：在體外試驗中，分別以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HCT116細胞株和原代結(jié)腸癌細胞為實驗對象，給予EGF 作用一定時間后用流式細胞技術(shù)檢測細胞增殖狀況及CD133+細胞比例變化，并將分選后的CD133+細胞經(jīng)EGF 刺激后檢測細胞增殖狀況；給予腫瘤細胞EGF 及5-Fu 聯(lián)合作用一定時間后通過流式細胞儀檢

2、測腫瘤細胞的凋亡和增殖狀況。在動物實驗中，分別建立人結(jié)腸癌HCT116細胞株和原代結(jié)腸癌細胞的裸鼠移植瘤模型，經(jīng)給予EGF和5-Fu 處理一段時間后，通過記錄各組腫瘤生長狀況的各項指標和流式細胞術(shù)檢測，分析評估周期誘導(dǎo)是否增強化療藥物的治療效果。
　　 結(jié)果：體外實驗中：1）EGF 作用后腫瘤細胞S+G2/M 期比例增多，Ki67表達增高，促進更多細胞進入細胞周期增殖；EGF 作用后CD133+細胞比例增加，且其中進入增殖期的細

3、胞比例也增加；2）5-Fu 作用后腫瘤細胞S+G2/M 期細胞比例減少，同時細胞凋亡增多；3）聯(lián)合使用EGF和5-Fu后，腫瘤細胞凋亡率高于單獨使用5-Fu組。動物實驗中：1）給予EGF后裸鼠移植瘤S+G2/M 期細胞比例增多，Ki67表達增高；CD133+細胞比例增加。2）不同方案給藥干預(yù)后，”EGF+5-Fu”組腫瘤重量小于5-Fu組。
　　 結(jié)論：
　　 1）EGF 能促使結(jié)腸癌細胞進入細胞周期并發(fā)生增殖，其中包括

4、對CD133+的結(jié)腸癌細胞。
　　 2）EGF 能夠增強化療藥物的對腫瘤的治療效果，其機制可能是使CSCs 進入細胞周期發(fā)生增殖，從而增加其對化療藥物的敏感性。
　　 第二部分
　　 目的：研究EGF 進行周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細胞的特性。
　　 方法：將體外實驗中EGF周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后獲得的殘余細胞進通過流式細胞儀檢測細胞周期主要細胞周期素（cyclin）的表達，并通過PI 法進行細胞周期分布分析

5、；CFSE 熒光法檢測細胞增殖以及細胞分裂狀況；再次給予化療藥物5-Fu后通過Annexin-V/PI 檢測細胞凋亡率來明確該部分細胞的耐藥性。在動物實驗中，檢測第一部分研究中各組裸鼠移植瘤細胞主要cyclin的表達以及細胞周期分布情況；將各組腫瘤取出后繼續(xù)傳代，并記錄腫瘤生長曲線；給予化療藥物5-Fu后研究各組腫瘤對化療藥物的耐藥性。
　　 結(jié)果：（1）細胞體外實驗：“EGF+5-Fu”組各主要cyclin表達明顯低于其他各組

6、，但各組細胞未見明顯的細胞周期阻滯現(xiàn)象；CFSE 法檢測發(fā)現(xiàn)“EGF+5-Fu”組細胞分裂以及增殖速度明顯低于其他各組；再次給予5-Fu后，“EGF+5-Fu”組細胞凋亡率較其他組明顯降低。2）動物實驗：“EGF+5-Fu”組細胞各主要cyclin表達明顯低于其他各組，但各組細胞未見明顯周期阻滯現(xiàn)象；各組腫瘤再次傳代后，“EGF+5-Fu”組生長速度明顯高于其他各組，繼續(xù)給予5-Fu 化療后，“EGF+5-Fu”組腫瘤重量高于其他各組，

7、HE切片顯示其惡性程度更高。
　　 結(jié)論：EGF周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后殘余的細胞是腫瘤細胞中一群cyclins表達很低、細胞周期運行很慢的腫瘤細胞，且其具有更高的惡性程度和很強的耐藥性，很有可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)耐藥的原因。
　　 第三部分
　　 目的：研究周期誘導(dǎo)聯(lián)合化療后耐藥腫瘤細胞是否具有CSCs的特性。
　　 方法：體外實驗中，用連續(xù)傳代檢測原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細胞的自我更新能力；克隆形成試驗

8、檢測原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細胞的成瘤能力。動物實驗中，用成瘤實驗檢測原代結(jié)腸癌“EGF+5-Fu”組細胞的成瘤能力，實時定量PCR檢測相關(guān)CSCs基因表達及CSCs表面標志。
　　 結(jié)果：體外實驗:“EGF+5-Fu”組細胞自我更新能力和成瘤能力強于其他各組細胞。動物實驗：“EGF+5-Fu”組細胞在裸鼠皮下成瘤能力強于其他各組細胞，“EGF+5-Fu”組細胞sox2、notch2表達較其他組增高，CD133 有相應(yīng)表