耐氟康唑白念珠菌ERG11基因突變篩查及鑒定芯片的研制.pdf

1、隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛應用和介入療法、器官移植等的深入開展，念珠菌感染呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，而抗真菌藥物的廣泛應用則加速了菌株的耐藥進程。從分子水平研究念珠菌對抗真菌藥尤其是唑類藥物的耐藥機制，解決念珠菌感染的快速診斷和有效治療問題，是目前的熱點。 唑類藥物的問世為治療念珠菌感染拓展了全新的空間，但在其藥物選擇壓力的作用下，念珠菌臨床分離株中耐藥株的比例明顯增加。念珠菌耐藥問題逐漸引起人們的重視，如何有效治療耐菌株的感染

2、正在漸漸成為一個新的醫(yī)學難題，菌種鑒定和藥敏試驗結果成為影響臨床治療和判斷預后的重要因素。 白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。從基因水平研究白念珠菌對唑類藥物的耐藥機制，國外的報道主要集中于歐美國家，國內研究則較少。目前認為，白念珠菌對唑類藥物耐藥存在多種機制，主要包括： (1)藥物靶酶基因ERG11突變或過度表達。(2)編碼多藥流出通道的基因(CDR1、CDR2、MDR1、FLU1)過度表達。(3)生物被膜的形成。(4)細胞內

3、液泡封閉藥物分子。 ERG11是羊毛甾醇14α-去甲基化酶的編碼基因，14α-去甲基化酶是念珠菌細胞膜麥角固醇合成途徑中的關鍵酶，對維持細胞膜的正常結構和功能具有重要意義。唑類抗真菌藥物分子可與14α-去甲基化酶分子結合，阻斷羊毛固醇去甲基化過程，影響麥角固醇合成。ERG11的突變可以改變14α-去甲基化酶的氨基酸序列，當這種改變足以影響酶分子的空間構型時，酶分子與藥物分子間的親和力可能被削弱，導致菌株耐藥。理論上，菌株.ERG

4、11基因的過度表達可以使14α-去甲基化酶表達增加，在有限濃度的藥物作用下，仍然維持良好的麥角固醇生物合成通路，也可以造成菌株耐藥。但現(xiàn)在多認為菌株耐藥性的形成與ERG11的過度表達無關，ERG11基因的突變才是這一耐藥機制的主要方面。迄今報道的ERG11基因錯義已逾70種，可以引起14α-去甲基化酶在61個氨基酸殘基上發(fā)生69種改變。其中，已經(jīng)實驗證實可以導致菌株對氟康唑耐藥的氨基酸置換僅有6種，即Y132H、T315A、S405F、

5、G464S、R467K和I471T。在單株耐藥菌株中，可以是多種耐藥機制并存，共同參與菌株耐藥性的形成；也可以是僅有一種機制起作用，例如，單純ERG11基因T541C點突變即可導致菌株耐藥。如果能夠利用分子生物學手段檢測到可以直接導致菌株耐藥的基因突變，即可以在不必進行藥敏試驗的情況下確定菌株的耐藥表型?；蛐酒夹g的出現(xiàn)和成熟，為這一設想提供了技術平臺。 基因芯片又被稱為DNA芯片(DNA chip)、DNA陣列(DNA ar

6、ray)、DNA微陣列(DNA microarray)等，該技術是近年出現(xiàn)的分子生物學與微電子技術相結合的核酸檢測分析技術，采用原位合成或顯微點樣技術將大量DN_A探針有序地固化于支持物表面，然后與帶有標記的核酸樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，獲得樣品的基因序列、基因表達等遺傳信息。該技術具有高度并行性、多樣性、微型化和快速自動化等特點，成為后基因組時代最重要的基因功能分析技術之一?；蛐酒夹g已經(jīng)滲透到生物科學領域的許多方面，有人

7、將其應用于念珠菌全基因組多種基因的檢測，并用于比較氟康唑敏感株和耐藥株間的差別，也有人將其用于包括念珠菌在內的真菌菌種鑒定，認為DNA芯片在菌種鑒定方面具有極高的敏感性和特異性。但在用DNA芯片檢測白念珠菌耐藥菌株方面，國內外均未見相關文獻報道。 目的:了解念珠菌臨床分離株的菌種分布情況和對氟康唑的敏感性。篩查白念珠菌ERG11基因的錯義突變，探討突變與氟康唑耐藥之間的關系。制備DNA芯片，鑒定常見的念珠菌種和可導致菌株對氟康唑

8、耐藥的ERG11突變，對DNA芯片技術應用于念珠菌菌種鑒定和藥敏鑒定進行初步探索。 方法：收集臨床標本，培養(yǎng)并分離念珠菌株，轉種于改良SDA.斜面上4℃保存。利用CHROMagar顯色培養(yǎng)基作為初篩手段，鑒定白念珠菌(含都柏林念珠菌)、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；輔以血清芽管生成試驗、蔗糖同化試驗、玉米土溫80厚壁孢子形成試驗來進一步確認白念珠菌和都柏林念珠菌；輔以四氮唑紅(TZC)還原試驗來進一步確認熱帶念珠菌；近平滑

9、念珠菌及其它念珠菌以VITEK2自動鑒定系統(tǒng)鑒定；PCR擴增白念珠菌(含都柏林念珠菌)25S rDNA轉座內含子保守序列，區(qū)分白念珠菌和含都柏林念珠菌并進行白念珠菌種內分型。聯(lián)合應用微量稀釋法和紙片擴散法，體外測定氟康唑對試驗菌株的MIC，確定敏感株(S)、劑量依賴敏感株(S-DD)和耐藥株(R)。微量稀釋法按照美國臨床試驗標準協(xié)會(CLSI)制定的M27-A2方案實施，判讀結果時，需對照紙片擴散法的結果，如結果相抵觸，則重復試驗再判讀

10、，最終以微量稀釋法結果為準。 參考白念珠菌ERG11標準序列(GeneBank X13296)設計3對引物，用Pfu高保真DNA多聚酶分段擴增全部白念珠菌臨床耐藥株、2株標準耐藥株、4株標準敏感株、部分臨床敏感株的ERG11基因，以其中ERG11序列已明確的2株標準耐藥株作為質控。用凝膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，將純化的PCR產(chǎn)物進行測序，檢測突變。 根據(jù)白念珠菌ERG11基因T541C、A1090G、C1361T、

11、G1537A、G1547A、T1559C等6種突變序列，每種突變設計至少2條等位基因特異性探針(PM)和1條錯配探針(MM)；根據(jù)白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌等6種真菌的內轉錄間隔區(qū)ITS2保守序列，分別設計1條種特異性探針。用OmniGridTM100點樣儀制備DNA芯片，每個探針重復三次，形成三個陣列。用雙重PCR方法擴增經(jīng)ERG11測序的白念珠菌和熱帶念珠菌C2a、光滑念珠菌Y10a、都

12、柏林念珠菌C8a、克柔念珠菌ATCC6258、近平滑念珠菌ATCC22019等5株標準株的ERG11和ITS2種特異性序列。用醋酸鈉/乙醇法純化雙重PCR產(chǎn)物，用DNase I進行酶切片段化，使酶切產(chǎn)物的片段長度在100 bp左右。針對T541C、A1090G、C1361T、G1537A、G1547A、T1559C等6種ERG11突變序列和白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌等6種常見條件致病性念珠菌

13、的內轉錄間隔區(qū)(IST2)種特異性序列，人工合成12條50 bp互補寡核苷酸鏈。用脫氧核苷酸末端轉移酶(TDT)對片段化的雙重PCR產(chǎn)物和50 bp寡核苷酸鏈進行Cy3熒光素標記后，進行芯片雜交。雜交后的芯片用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進行掃描，利用GenePix Pro提取每條探針的熒光信號強度值，做出菌種鑒定和突變檢測。 結論： (1)白念珠菌仍是最主要的致病性念珠菌，白念珠菌的分離比例和念珠菌對氟康