醛固酮增加致密斑細胞超氧陰離子合成及相關機制研究.pdf

1、本文對醛固酮增加致密斑細胞超氧陰離子合成及相關機制進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：醛固酮誘導致密斑細胞產(chǎn)生超氧陰離子。
　　 目的：近年來，氧化應激在高血壓等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用引起人們廣泛關注。有研究報道心肌梗死和心衰病人體內醛固酮水平明顯增高，會導致心臟炎癥發(fā)生，該過程伴有心肌細胞氧化應激損傷和環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase2，COX-2)等大量炎性介質的釋放。在腦和腸系膜動脈

2、中，醛固酮能夠通過釋放一氧化氮(Nitric oxide，NO)介導血管舒張，同時還能夠激活NAD(P)H氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase)使細胞內超氧陰離子(Superoxide，O2-)生成增多。在對體外培養(yǎng)的動脈上皮細胞系研究中也發(fā)現(xiàn)醛固酮通過刺激NAD(P)H(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-ox

3、idase)氧化酶增加O2-的生成。另外，有人提出在臨床治療中及時糾正氧化/抗氧化失衡，可顯著降低慢性腎衰病人并發(fā)心血管疾病的危險性。管球反饋(Tubuloglomerular glomerular feedback，TGF)是調節(jié)腎血流動力學、NaCl排泄和血壓的重要機制。當流經(jīng)腎致密斑血流量增加時，通過TGF反應可引起腎小球入球小動脈收縮，從而使腎小球率過濾降低。致密斑(Maculadensa，MD)細胞釋放一氧化氮可以調節(jié)TGF功

4、能，而同樣由MD合成的O2-則可使NO失活。我們在近期研究中發(fā)現(xiàn)NAD(P)H氧化酶NOX-2和NOX-4亞型在大鼠MD和MMDD1(Macula dense like cell line)細胞中都有表達。雖然醛固酮能誘導心臟和血管發(fā)生氧化或炎癥過程，但其在MD細胞中的作用機制還尚不清楚。鹽皮質激素受體(Mineralocorticoid receptor，MR)可被醛固酮激活，該受體在機體中分布廣泛，其中包括腎遠曲小管和集合管等，但在

5、MD細胞中是否有表達卻尚無報道。我們推測醛固酮可能通過激活MD細胞上MR而增加O2-合成，此過程是由COX-2增加和NOX-2、NOX-4激活介導的。該研究有助于進一步了解醛固酮引起的氧化應激在高血壓和高血壓相關靶器官(心臟和腎臟等)損傷中的作用，為臨床治療提供新的干預靶點。
　　 方法：⑴使用lucigenin增強化學發(fā)光法檢測MMDD1細胞中O2-的量。操作步驟主要為，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solu

6、tion，PBS)沖洗細胞兩次，1 mL胰酶消化1 min，離心，去上清后，加入12 mL Krebs/Hepes緩沖液制備細胞懸濁液。然后分別進行以下五種處理：無處理組：醛固酮(10-8mol/L)組；醛固酮+COX-2阻斷劑(NS39810-6mol/L)組；醛固酮+NAD(P)H阻斷劑(apocynin10-5 mol/L)組；醛固酮+COX-2+NAD(P)H阻斷劑(醛固酮10-8mol/L，NS39810-6 mol/L和ap

7、ocynin10-5mol/L)組。同時每組加入lucigenin(5×10-6 mol/L)37℃水浴30 min后上機檢測。⑵使用RNcasy Mini kit提取MMDD1細胞和小鼠心肌細胞tRNA。逆轉錄合成cDNA后，按以下步驟擴增COX-2、NOX-2、NOX-4和MR目的片段。1)1μLcDNA產(chǎn)物，1μL特異性引物，2μL10× PCR緩沖液，1μL dNTP2.5 mmol/L，0.2μL Super Taq酶(5 U

8、/μL)，NOX-2和NOX4的PCR體系中加入1.2μL50％甘油，最后加入去RNAase水使體系總體積達到20μL。2)PCR條件為：94℃3 min，循環(huán)條件為94℃20 sec，59.4℃(COX-2)，56.6℃(NOX-2)，52.9℃(NOX-4)30 sec，72℃30 sec并循環(huán)40次。最后延長72℃8 min。3)MR受體的PCR體系為50μL其中包括1μL MMDD1 cDNA或是1μL小鼠心肌cDNA、MR引物

9、和Taq多聚酶。PCR條件為，95℃2 min，循環(huán)條件為95℃40 Sec，退火溫度為58℃40sec，72℃55 sec并循環(huán)40次。最后延伸72℃8 min。電泳分離產(chǎn)物，觀察拍照。β-actin作為內參。⑶醛固酮處理MMDD1細胞30 min后，使用RNeasy Micro kit(Qiagen)提取細胞tRNA，然后逆轉錄成cDNA。最后使用C1000TM Thermal Cycler real-time PCR儀參照說明書進

10、行實驗。檢測COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA。β-actin作為內參。⑷使用COX-2 siRNA(Ambion，美國)轉染MMDD1細胞，以沉默COX-2基因。轉染使采用siPORTTM Amine Transfection Agent(Ambion，美國)作為轉染輔助物。Scrambled siRNA(Invitrogen，美國)作為陰性對照。實驗流程為：在轉染之前24 h，準備MMDD1細胞，將細胞分到6孔細胞培養(yǎng)盤中

11、(2×105細胞/孔)，并且使用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細胞數(shù)為80％左右時，進行轉染實驗。轉染時，將COX-2 siRNA10 nmol/L和Amine Transfection Agent加入到培養(yǎng)細胞中共孵育18 h。然后，PBS沖洗細胞一次后更換正常細胞培養(yǎng)液，轉染24 h后檢測siRNA轉染效率。⑸RIPA緩沖液(加入蛋白酶抑制劑混合物)離心提取蛋白之后，使用Nanodrop分光光度計檢測蛋白濃度，光波長度設定為280 nM。

12、蛋白樣本經(jīng)電泳和轉膜后，1％脫脂奶粉TTBS室溫封閉一小時。根據(jù)研究目的，分別使用以下一抗，包括：1)MR受體-抗混合rMR1-18 clone1D5(1:50)和MRN365 clone2D6(1:100)。2)兔來源抗COX-2抗體(1:500)；兔來源抗NOX-2抗體(1:1000)；3)兔來源抗NOX-4抗體(HRP)(1:1000)；4)小鼠來源抗GAPDH抗體(1:5000)，在4℃孵育過夜。然后TTBS多次沖洗，室溫下辣根

13、過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)標記的二抗(1:10000)孵育1 h(NOX-4除外)，ECL顯影。Western blot條帶采用VersaDoc image analysis system(Bio-Rad)進行分析。GAPDH作為內參蛋白。⑹采用單因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤表示，以P<0.05為顯著性差異界值。

14、
　　 結果：①MMDD1細胞上存在MR受體。本實驗從mRNA水平和蛋白水平證實MMDD1細胞上有鹽皮質激素受體(MR)表達。②醛固酮通過激活MMDD1細胞上MR受體產(chǎn)生超氧陰離子O2-。醛固酮(10-8mol/L)處理細胞30 min后，O2-生成量從1260.9±50.9 RLU·s-1·105cells-1增加到2463.5±145.2 RLU·s-1·105cells-1。而細胞經(jīng)MR受體拮抗劑eplerenone預孵育

15、后再加入醛固酮，結果顯示eplerenone完全阻斷醛固酮誘發(fā)MMDD1細胞增多超氧陰離子O2-的效果，O2-生成量為1264.4±50.0 RLU·s-1·105cells-4。③RT-PCR結果顯示MMDD1細胞上有COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表達。④醛固酮增加MMDD1細胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表達。平行比較不同濃度醛固酮(10-9mol/L和10-8mol/L)對MMDD1細胞，COX-2、NO

16、X-2和NOX-4蛋白表達量影響，發(fā)現(xiàn)10-8mol/L濃度的醛固酮，蛋白上調作用最為顯著。醛固酮(10-8mol/L)處理細胞30 min后，MMDD1細胞中COX-2、NOX-2和NOX-4蛋白表達明顯增多，其增加量分別為對照組的1.78±0.05倍、2.31±0.07倍和2.33±0.14倍。⑤醛固酮通過COX-2、NOX-2和NOX-4影響MMDD1細胞超氧陰離子O2-生成。我們在觀察不同阻斷劑對醛固酮引起MMDD1細胞O2-合

17、成增多的影響中發(fā)現(xiàn)，NS-398(10-6 mol/L)(COX-2阻斷劑)，apocynin(10-5mol/L)(NAD(P)H氧化酶阻斷劑)或是同時加入NS-398(10-6mol/L)和apocynin(10-6mol/L)預處理細胞都能夠完全阻斷醛固酮刺激MMDD1細胞內O2-生成增多的作用。⑥siRNA對MMDD1細胞中COX-2表達的影響。COX-2 siRNA顯著降低MMDD1細胞中COX-2 mRNA表達。Scramb

18、led siRNA對COX-2 mRNA則無明顯作用。COX-2 siRNA對NOX-2 mRNA和NOX-4 mRNA表達無影響。以上結果表明該COX-2 siRNA對MMDD1細胞中COX-2沉默作用具有特異性和高效性。⑦COX-2 siRNA對醛固酮誘導MMDD1細胞超氧陰離子O2-合成增多的影響。使用醛固酮(10-1mol/L)刺激MMDD1細胞30 min，細胞中COX-2、NOX-2和NOX-4 mRNA表達明顯增多。而使用

19、COX-2 siRNA選擇性沉默COX-2后，再用醛固酮刺激MMDD1細胞，結果顯示醛固酮增加COX-2、NOX-2和NOX-4mRNA水平的作用被阻斷。為進一步驗證COX-2在醛固酮誘導細胞產(chǎn)生超氧陰離子O2-過程中的作用，我們使用COX-2 siRNA預處理MMDD1細胞后，再檢測其中超氧陰離子O2-水平。結果顯示，醛固酮刺激MMDD1細胞內超氧陰離子O2-釋放增多，而COX-2 siRNA預處理細胞則逆轉醛固酮該效果。
　　

20、 結論：在MMDD1細胞中，醛固酮作用于MR受體，刺激細胞內COX-2表達增多，激活NAD(P)H氧化酶亞基NOX-2和NOX-4，從而引起細胞合成超氧陰離子O2-增加。
　　 第二部分：PKCα在醛固酮誘導致密斑細胞產(chǎn)生超氧陰離子中的作用。
　　 目的：醛固酮能激活結腸和腎小管(遠端小管、收集小管和集合管等)上皮細胞上鹽皮質激素受體(Mineralocorticoid receptors，MR)，引起電解液流量增加；

21、它還能誘導心臟炎癥和心肌氧化應激的發(fā)生。在論文第一部分我們主要闡述了醛固酮通過激活COX-2和NAD(P)H氧化酶導致MMDD1細胞生成O2-產(chǎn)物增多。但醛固酮該促氧化作用由何種細胞信號通路傳導尚不清楚。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是介導細胞對類固醇類激素發(fā)生快速反應的一種信號轉導蛋白。有研究報道醛固酮能增加腎皮質集合管細胞中的鈉離子轉運，該作用是經(jīng)由PKCα信號通路介導。因此，我們推測PKCα可能參與了醛固酮

22、通過刺激NOX-2和NOX-4導致MD細胞中的O2-產(chǎn)物增加的促氧化作用，并在本次研究中對該假設進行驗證。
　　 方法：（同第一部分）
　　 結果：⑴NAD(P)H氧化酶抑制劑阻斷醛固酮刺激MMDD1細胞產(chǎn)生O2-的作用。醛固酮(10-8mol/L)刺激MMDD1細胞30 min后，O2-生成量明顯增多，從1293±106 RLU·s-1·105cells-1升高到2349±222 RLU·s-1·105cells-1。

23、同時加入醛固酮和NAD(P)H氧化酶抑制劑apocynin處理MMDD1細胞30 min，醛固酮刺激MMDD1細胞合成O2-增多的效果被阻斷。⑵PKC抑制劑減弱醛固酮對MMDD1細胞促氧化作用。醛固酮(10-8mol/L)處理MMDD1細胞30 min后，O2-生成量從1184±54 RLU·s-1·105cells-1增加到1982±138 RLU·s-1·105cells-1。同時加入醛固酮和PKC抑制劑CC(Chelerythri

24、nechloride)刺激MMDD1細胞30 min，醛固酮誘導MMDD1細胞O2-合成增多的效果明顯減弱，表明PKC抑制劑阻斷醛固酮促氧化作用。⑶PKCα特異性抑制劑減弱醛固酮促氧化作用。為驗證PKC亞型是否參與醛固酮促氧化作用，我們在實驗中使用PKCα特異性抑制劑Go6976(Go)。醛固酮(10-8mol/L)明顯增加MMDD1細胞合成O2-的作用。而同時加入醛固酮和Go6976(Go)處理細胞30 min后，醛固酮誘導MMDD1

25、細胞O2-合成增多的效果被阻斷，表明PKCα參與醛固酮該促氧化作用。⑷PKCα siRNA阻斷醛固酮對MMDD1細胞促氧化作用。為進一步證實PKCα在醛固酮促氧化途徑中的作用。我們在實驗中使用PKCα siRNA，經(jīng)驗證PKCαsiRNA能有效沉默PKCα mRNA。醛固酮(10-8 mol/L)刺激后明顯增加MMDD1細胞合成O2-量，而使用PKCα siRNA預處理細胞18 h則逆轉醛固酮該誘導作用。⑸PKCα siRNA阻斷醛固酮

26、誘導的MMDD1細胞中NOX-2和NOX-4表達上調的作用。醛固酮(10-8mol/L)刺激30 min后使MMDD1細胞內NOX-2和NOX-4蛋白表達明顯上調，而使用PKCα siRNA預處理則阻斷醛固酮該誘導作用。該結果表明醛固酮刺激MMDD1細胞內NOX-2和NOX-4蛋白表達增加是通過PKCα通路介導。
　　 結論：醛固酮誘導MMDD1細胞O2-產(chǎn)物生成增多的作用是由PKCα-NAD(P)H氧化酶途徑介導的。MD細胞中