探討高壓氧對缺氧-復氧模型下大鼠骨髓間充質干細胞的影響及相關機制研究.pdf

1、目的:
　　脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重創(chuàng)傷性疾病，其致殘率及病死率均較高，所造成的部分或完全運動神經(jīng)、感覺神經(jīng)缺失給患者的生活造成巨大的影響。脊髓損傷的修復和治療一直是世界研究的熱點和難點。而干細胞的發(fā)現(xiàn)是人類發(fā)育生物學和疾病研究中的重大突破。干細胞是具有增殖和分化潛能的細胞，具有自我更新復制的能力，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細胞，是形成哺乳類動物的各組織器官的原始細胞，這種多能性使得干

2、細胞具有巨大的生物醫(yī)學工程學潛能。
　　骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有高度的自我復制能力和多向分化潛能，在一定的誘導條件下可跨胚層分化為神經(jīng)細胞，從而替代缺損的神經(jīng)功能;能促髓鞘再生、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌;調控炎癥反應，減輕繼發(fā)性損傷對原位神經(jīng)元的毒害性。許多研究已經(jīng)表明，骨髓間充質干細胞能夠定向遷移到損傷組織中并定植（歸巢），發(fā)揮其龐大的神經(jīng)修復作用。然而，當移植外源性骨髓間充質干細胞后，缺血病灶中僅有2％存活，這與脊髓損傷引起

3、的繼發(fā)性損傷，包括谷氨酸鹽毒性物質、超載氧自由基、炎癥細胞、各種細胞因子等有關。如何提高骨髓間充質干細胞在病灶中的存活率成為目前新的研究靶點。
　　高壓氧在神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病中的應用已得到廣泛的認可。其主要機制包括:①神經(jīng)細胞對氧有特殊的依賴性和敏感性，而高壓氧能顯著提高患者動脈血氧分壓及組織氧儲量，增加氧彌散距離，改善脊髓缺氧狀態(tài)。②高壓氧能提高紅細胞變形能力，降低毛細血管通透性。③高壓氧能擴張機體動脈，促進血流速度，減少血小板

4、聚集，降低血液粘滯度，從而增加脊髓供血。④高壓氧糾正酸中毒，改善脊髓損傷部位的微循環(huán)及血流灌注，維持神經(jīng)細胞能量代謝，并恢復可逆性損傷的神經(jīng)元功能。研究表明，高壓氧能夠調控凋亡家族中Bax、Bcl-2在脊髓損傷中的表達，維持線粒體細胞膜電位的穩(wěn)定性，減少細胞色素C的釋放，阻斷其下游caspase-3的級聯(lián)反應而發(fā)揮抗凋亡作用。除此之外，高壓氧還能促進內源性神經(jīng)干細胞的增殖，誘導其向神經(jīng)元分化，這可能與Wnt/β-catenin通路有關。

5、已有文獻報道聯(lián)合高壓氧治療的干細胞移植可明顯改善神經(jīng)缺損癥狀，但當中的機制仍未明了。
　　Wnt通路在胚胎的發(fā)育過程中對細胞的增殖、分化、死亡、遷移和極化均起到重要的作用。β-catenin是經(jīng)典Wnt通路中的核心調控因子，其表達水平?jīng)Q定著通路的開放與否。本實驗通過模擬體內缺血再灌注損傷環(huán)境，探討高壓氧對骨髓間充質干細胞的保護機制，為細胞治療學應用于脊髓損傷中的發(fā)展提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、大鼠骨髓間充質干細

6、胞(BMSCs)的收集、培養(yǎng)及流式細胞鑒定細胞表面標志:選取健康的3-4周雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)，采用全骨髓貼壁法種植于25cm2培養(yǎng)瓶中。待細胞傳至P3后選取CD29、45、90抗體并使用流式細胞儀鑒定細胞。
　　2、分組:將P3-P5細胞隨機分成四組:正常對照組、缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高壓氧組、缺氧/復氧+高壓氧+YC-1組。缺氧/復氧處理組種板24h后倒去完全培養(yǎng)基，無菌PBS沖洗1遍，更換

7、為不含血清的L-DMEM培養(yǎng)，置于95％N2、5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)9h后取出細胞，更換為5％完全培養(yǎng)基，復氧2h。正常對照組更換為完全培養(yǎng)基并置于常氧環(huán)境中培養(yǎng)。高壓氧組于復氧2h后介入。
　　3、高壓氧處理:將細胞置于高壓氧艙中，以含98％O2的混合氣體洗艙10min，關閉艙門，然后在15分鐘內升壓至0.25，維持60min，隨之在15min之內將艙內壓力恢復至正常氣壓，1次/12h，連續(xù)3次。穩(wěn)壓期間艙內平均氧濃度

8、不得低于98％。高壓氧處理同時將非高壓氧組置于同等氧艙中90min。
　　4、Hoechst33258染色觀察細胞凋亡:以3×104/ml的密度接種于6孔板，處理結束12h后棄上清，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗滌5min×2遍，向孔內滴加入500ulHoechst33258避光染色10 min，PBS洗滌5min×3遍，熒光顯微鏡下觀察拍照。
　　5、CCK-8檢測細胞毒性及增殖:以3×104/ml將細胞種植于96孔

9、板中，每組設復孔4個，分別處理后向復孔中加入10ul CCK-8溶液，充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2h，用酶標儀450nm波長測定各組吸光度，去除最大值及最小值，取其平均值后，按公式計算各組存活率，以OD值作細胞增殖曲線圖。同時設置空白對照組。
　　6、流式細胞儀檢測細胞凋亡:以5×104/ml將細胞種植于60mm培養(yǎng)皿中，給予不同處理結束后吸取上清液至離心管，貼壁細胞用PBS洗滌，胰酶消化后將細胞轉入相應離心管，1000

10、r/min離心5min，收集細胞。PBS洗滌兩次后加入500μlAnnexinⅤ結合液懸浮細胞，再加入5ul AnnexinⅤ-FITC染色液，再加入5ul PI染色液室溫孵育15 min，上流式細胞儀檢測，采用Cell Quest軟件進行結果分析。
　　7、Hoechst33258/PI雙染觀察細胞凋亡形態(tài)學:以5×104/ml將細胞種植于60mm培養(yǎng)皿中，處理結束12h后吸取上清并收集細胞，PBS調整濃度至106個/ml，取1

11、00ul細胞懸液，加入已混勻的Hoechst33258/PI(300ul∶6ul)染料，常溫下避光孵育20min，取10ul滴于載玻片，加上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照。
　　8、Western blot檢測蛋白表達水平:冰上裂解各實驗組蛋白后，分別收集到1mlEP管中，離心(12000rpm，4℃，20 min)，用蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度并調整至同一水平。依次經(jīng)過電泳、轉膜、一抗和二抗孵育、顯影及成像。凝膠成像系統(tǒng)掃描

12、并分析HIF-1α、β-catenin、LEF-1、Cl.aspase-3、Bcl-2蛋白表達變化。
　　結果:
　　1、細胞的生長、形態(tài)及鑒定:
　　培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞為圓形，大小不等，呈懸浮狀，其間混有大量造血干細胞。培養(yǎng)48 h換液后，顯微鏡下可見呈圓形的折光性強的胞體;隨著時間延長，貼壁細胞不斷增多，細胞呈長梭形、有細小的突起，部分形成細胞集落。原代培養(yǎng)的細胞在1周左右融合達到80％-90％時可進行傳代，此

13、時細胞呈旋渦狀或放射狀排列。傳代后細胞增殖速度增加，細胞純度較高。流式細胞儀檢測顯示CD29和CD90高表達，分別為96.23+2.02％和97.28±1.3％，不表達造血干細胞特異性標記CD45，其陽性率為1.68±0.73％，符合間充質干細胞表面標記物的一般表達情況。
　　2、Hoechst33258染色:
　　正常組中由于DNA的完整性，細胞核染色后呈均一深藍色，而缺氧/復氧組細胞核由于凋亡引起DNA雙鏈結構被破壞，染

14、色質濃縮，Hoechst染色后呈亮藍色;隨著缺氧/復氧時間的延長，凋亡的細胞數(shù)目不斷增加，亮藍色細胞核數(shù)目也逐漸增多。
　　3、CCK-8:
　　與正常組相比，缺氧/復氧組細胞存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義;給予高壓氧處理后，細胞存活率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義;高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達后，細胞存活率明顯下降(P＜0.05);與正常對照組相比，高壓氧處理組的骨髓間充質干細胞并無明顯增殖(P＞0

15、.05)。
　　4、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例:
　　與正常組相比，缺氧/復氧組隨著缺氧時間的延長，細胞發(fā)生凋亡比例逐漸增多，選取缺氧9h，復氧2h作為造模標準;與缺氧/復氧組相比，給予高壓氧處理3次后，細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05);高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達后，細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　5、Hoechst33258/PI雙染觀觀察細胞凋亡比例:
　　熒光顯微鏡下可見

16、，與缺氧/復氧組相比，給予高壓氧處理后，PI陽性細胞比例有所下降（P＜0.05）;高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達后，PI陽性細胞比例明顯升高(P＜0.05)。
　　6、Western blot檢測蛋白表達水平:
　　Western blot結果顯示缺氧/復氧后HIF-1α表達與正常對照組相比無明顯差異(P＞0.05);高壓氧處理能夠誘導HIF-1α表達，給予YC-1阻斷劑后，HIF-1α表達明顯降低P＜0

17、.05）;和缺氧/復氧組相比，高壓氧處理組β-catenin、LEF-1表達增高，核內β-catenin表達增高，該作用可被YC-1阻斷劑所抵消，三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這說明高壓氧可能通過HIF-1α調控Wnt通路開放，從而發(fā)揮抗凋亡能力。與正常組相比，缺氧/復氧組Cl.aspase-3表達明顯增高，同時Bcl-2表達下降，給予高壓氧處理后Cl.aspase-3表達降低，Bcl-2表達增高，差異均具有統(tǒng)計學