CD163分子在PRRSV-ADE中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種B類病毒性傳染疾病，該病毒在臨床上主要造成妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎以及引起仔豬呼吸障礙，還會(huì)引起豬群的免疫抑制和持續(xù)性感染等免疫學(xué)特性。PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，易變異，具有抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE）。研究PRRSV的ADE作用機(jī)制對(duì)PRRS的防治和新型疫苗的研制具有重要意義。
　　PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，在體內(nèi)外均能夠入侵感染單核-巨噬

2、細(xì)胞，而受體是介導(dǎo)病毒入侵宿主的決定因素。目前人們對(duì)PRRSV感染PAM過程的認(rèn)識(shí)是：首先HS將PRRSV粒子吸附到細(xì)胞表面，引起Sn N端唾液酸結(jié)合位點(diǎn)與病毒的GP5/M復(fù)合體結(jié)合，激活Sn信號(hào)通道誘發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，之后在CD163分子的作用下將PRRSV基因組mRNA釋放到細(xì)胞漿中，繼而完成細(xì)胞的復(fù)制過程。還有研究表明CD163分子的SRCR5的結(jié)構(gòu)域可以與病毒粒子的GP2和GP4蛋白發(fā)生相互作用。然而目前對(duì)于CD163分子在PR

3、RSV入侵宿主細(xì)胞的過程中的作用機(jī)制還不是十分清楚，而且對(duì)其在PRRSV-ADE過程中的是否發(fā)揮作用的研究還未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)分4個(gè)片段克隆并原核表達(dá)CD163分子胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，免疫小鼠得陽性血清，制備并純化其相應(yīng)的特異性多克隆抗體，通過研究這些抗體是否能夠阻斷PRRSV和免疫復(fù)合物的感染來鑒定CD163分子在PRRSV入侵過程中的作用，以及探索其在PRRSV-ADE中的作用。
　　清道夫受體CD163蛋白大小是130KDa，故

4、被稱為M130蛋白，是Ⅰ型糖基化蛋白，富含半胱氨酸。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)分析豬PAM的CD163發(fā)現(xiàn)其包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)，且胞外區(qū)含有一個(gè)信號(hào)肽（1-40AA）和9個(gè)富含半胱氨酸（SRCR）結(jié)構(gòu)域，且1-9個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域在CD163中的位置分別是54AA-151AA，161AA-258AA,268AA-365AA,375 AA-472AA,480AA-577AA，585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA，

5、931AA-1028AA。本試驗(yàn)將CD163分子分四個(gè)片段進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，即CD163-P1（SRCR1-2），CD163-P2（SRCR3-4），CD163-P3（SRCR5-6）和CD163-P4（SRCR7-9）。用四種重組蛋白分別免疫小鼠制備多克隆抗體血清，經(jīng)硫酸銨鹽析法和 DE-52離子交換層析技術(shù)二步法提取并純化得到四種純度較高的特異性抗體。用PBS灌洗法將豬肺泡原代巨噬細(xì)胞洗出并鋪板，之后加入四種純化后的抗 CD163

6、抗體和混合抗體孵育1h封閉 PAM細(xì)胞，再分別用Hn-1/06 PRRSV和4倍稀釋的PRRSV-IgG免疫復(fù)合物處理細(xì)胞24h和48h，并設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照組。用已建立的PRRSVSYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中PRRSV的mRNA水平再用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行處理所得到的數(shù)據(jù)。
　　試驗(yàn)一首先從健康仔豬肺泡中收集豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），提取細(xì)胞總 RNA，參照GenBank: EU0

7、16226.1四個(gè)不同片段設(shè)計(jì)四對(duì)特異性引物，再用RT-PCR方法擴(kuò)增出四個(gè)CD163基因片段，長(zhǎng)度分別為698bp、721bp、609bp和988bp，并將這些基因片段亞克隆到質(zhì)粒載體PET-32a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-CD163-P1, PET-CD163-P2, PET-CD163-P3和PET-CD163-P4。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到成功表達(dá)，表達(dá)蛋白大小分別約為44.2kDa、45 kDa、

8、41.4kDa和52.0 kDa，與預(yù)測(cè)的融合蛋白大小一致。通過優(yōu)化 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)間和最適濃度，大量表達(dá)重組蛋白 CD163-P1，CD163-P2，CD163-P3和 CD163-P4，并用尿素法洗滌純化重組蛋白。用四種純化重組蛋白分別免疫小鼠，制備抗四種重組蛋白的多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)陽性抗體血清效價(jià)分別為1：10240，1：12800，1：25600和1：12800。采用硫酸銨鹽析法粗提抗體IgG，再經(jīng)D

9、E-52纖維素離子交換層析技術(shù)方法純化粗提IgG，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。
　　試驗(yàn)二用試驗(yàn)一所制備的四種抗體，以及四種抗體的混合物分別封閉PAM細(xì)胞1h，經(jīng)PRRSV感染24h和48h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照組，用已建立的絕對(duì)熒光定量PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中PRRSV的mRNA水平，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行處理所得到的數(shù)據(jù)。由試驗(yàn)結(jié)果看出，PRRSV感染24h和48h時(shí)，鼠抗豬CD163-P1，CD16

10、3-P2和CD163-P4抗體封閉組病毒 mRNA復(fù)制水平與相應(yīng)的鼠陰性 IgG對(duì)照組比較差異不明顯，而鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組和混合抗體CD163-H封閉組的PRRSV mRNA拷貝數(shù)均顯著低于鼠陰性IgG組，并且鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組在24h時(shí)間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對(duì)照組的0.78倍（P<0.01），在48h時(shí)是對(duì)照組的0.85倍（P<0.05）。表明此方法所制備的鼠抗豬CD163-P3抗體能

11、夠阻礙PRRSV感染PAM細(xì)胞，并暗示CD163-P3（SRCR5-6）可能參與PRRSV感染PAM細(xì)胞過程，其他片段不影響PRRSV的感染宿主過程，這與人們所認(rèn)為的CD163分子的主要功能結(jié)構(gòu)域可能是SRCR5相一致。同時(shí)這些還表明用本試驗(yàn)方法所制備、提取和純化的抗體具有生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究 PRRSV感染機(jī)制及PRRSV-ADE作用機(jī)制提供參考。
　　試驗(yàn)三用試驗(yàn)一所制備的抗體，以及四種抗體的混合物分別封閉PAM細(xì)胞，再以

12、4倍稀釋的免疫復(fù)合物（PRRSV-IgG）處理24h和48h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照組以及純病毒組，用已建立的絕對(duì)熒光定量 PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中 PRRSV的mRNA含量，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行處理所得到的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在免疫復(fù)合物處理24h和48h時(shí)，鼠抗豬CD163-P1和CD163-P2抗體封閉組的PRRSV mRNA拷貝數(shù)與相應(yīng)的鼠陰性IgG對(duì)照組比較均差別不大；鼠抗豬CD163-P3抗體組的PRRS

13、V增殖水平均卻顯著低于對(duì)照組，且鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組在24h時(shí)間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對(duì)照組的0.87倍，在48h時(shí)是對(duì)照組的0.75倍（P<0.01）；鼠抗豬CD163-P4抗體組的PRRSV mRNA拷貝數(shù)均低于鼠陰性IgG對(duì)照組，但差異不顯著；而鼠抗豬CD163-H抗體組PRRSV mRNA拷貝數(shù)均顯著低于鼠陰性IgG對(duì)照組，在24h時(shí)間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對(duì)照組的0.88倍（

14、P<0.05），在48h時(shí)是對(duì)照組的0.83倍（P<0.05），表明鼠抗豬 CD163-P3抗體能夠影響PRRSV-IgG在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖，暗示受體CD163-P3可能參與免疫復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的增殖。我們推測(cè)免疫復(fù)合物侵入宿主細(xì)胞后通過PRRSV的GP2a和GP4蛋白與CD163分子相互作用，改變PRRSV的結(jié)構(gòu)，促使mRNA釋放到細(xì)胞漿中，繼而完成PRRSV的復(fù)制增殖，而且發(fā)揮主要功能作用的部分是CD163-P3（SRCR5-6），而