CD38分子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的表達和作用機制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵襲性滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞為臨床特征的自身免疫性疾病?；疾∪藬?shù)占世界人口的0.5％～1.0％，在我國的患病率約為0.32％～0.36％。在RA的自然病程中，其致殘率高達15％，成為威脅人類健康的殺手。因此早期診斷和治療至關(guān)重要。
　　跨膜糖蛋白CD38分子廣泛表達于淋巴細胞，既是細胞表面受體又具有酶活性，可以催化環(huán)二磷酸腺苷核糖(cyclic adenosin

2、e diphosphate ribose，cADP)和煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate，NAADP)兩種鈣信使物質(zhì)的代謝，參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖與凋亡、分化成熟和遷移，是淋巴細胞活化的表面標(biāo)記。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD38分子功能的喪失與固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答改變和損傷密切相關(guān)，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。
　　為進一步闡明CD38分子

3、是否通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與RA發(fā)病，本課題通過臨床和體外細胞實驗研究CD38分子在RA患者外周血淋巴細胞亞群的分布和其調(diào)節(jié)機制，為以CD38分子作為靶點的小分子化合物治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分
　　目的:
　　研究CD38在RA患者體內(nèi)不同淋巴細胞亞群中的表達差異及RA外周血淋巴細胞CD38表達水平的影響因素;RA患者不同淋巴細胞亞群分布格局和激活狀態(tài)，著重研究RA外周血NK細胞數(shù)量和表型變化。
　　方法:<

4、br>　　隨機選取RA患者139例為病例組，年齡、性別匹配的正常健康人群120例為健康對照組。詳細采集患者人口學(xué)特征（性別、年齡）、病程、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(TJC)、VAS評分、類風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-CCP)、血沉(ESR)、C反應(yīng)蛋白（CRP）、計算疾病活動指數(shù)(DAS28-CRP)，關(guān)節(jié)骨侵蝕分級。采用多色流式細胞術(shù)檢測NK(CD3-CD56+)細胞、T(CD3+)、B(CD19+)淋巴細胞

5、比例和CD38陽性NK、T、B(CD19+)淋巴細胞比例。一般線性模型分析影響RA外周血NK細胞比例的相關(guān)因素。Pearson和Spearman等級相關(guān)分析CD38陽性總淋巴細胞比例與臨床指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。線性相關(guān)分析CD38陽性總淋巴細胞比例與疾病活動性指標(biāo)CRP、DAS28-CRP的相關(guān)系數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.RA患者外周血T淋巴細胞(CD3+)和輔助/誘導(dǎo)T淋巴細胞(Th細胞CD3+CD4+)比例高于健康對照組，兩

6、組間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0065;P=0.0038)。抑制/細胞毒T細胞（Ts細胞CD3+CD8+）和B淋巴細胞(CD19+)比例兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.613;P=0.587)。RA患者NK細胞(CD3-CD56+)占淋巴細胞的比例低于健康對照組，兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.033)。中高度活動組RA患者NK細胞在外周血的下降尤為顯著?；颊咄庵苎狢D38+總淋巴細胞比例顯著高于健康對照組(P=1.91E-09)。CD38分子在

7、Th淋巴細胞和NK細胞表達均顯著高于健康對照組(P值均小于0.05)，而CD38+B淋巴細胞和CD38+Ts細胞比例在RA和健康人群兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均大于0.05)。
　　2.一般線性模型分析顯示，RA患者外周血NK細胞比例不受年齡、病程、關(guān)節(jié)骨侵蝕分級的影響，主要受疾病活動度的影響。
　　3.Pearson和Spearman等級相關(guān)分析提示，RA患者外周血CD38在淋巴細胞表達頻數(shù)與CRP、疾病活動度(DAS28-

8、CRP)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而與類風(fēng)濕血清標(biāo)志物(RF、anti-CCP)是否陽性，年齡、病程、骨侵蝕分級無相關(guān)關(guān)系。線性回歸分析CD38總淋巴細胞表達頻數(shù)與CRP、DAS28-CRP相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.255和R2=0.288。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者外周血中Th細胞、NK細胞均高表達活化標(biāo)記CD38分子，說明以上兩種細胞處于激活狀態(tài)，
　　2.RA患者外周血NK細胞比例較健康人群減少，其比例受到疾病活動度影響

9、。
　　3.CD38在淋巴細胞表達頻數(shù)與CRP、DAS28-CRP呈線性正相關(guān)關(guān)系。
　　第二部分
　　目的:
　　研究NK細胞及其CD38陽性亞群在RA患者外周血、滑液、滑膜組織中的分布特征。
　　方法:
　　選取合并單或雙側(cè)膝關(guān)節(jié)積液的RA患者36例，以及性別、年齡與RA患者匹配的29例來自體檢中心的正常健康人作健康對照組。流式細胞儀檢測健康人外周血和患者配對的外周血、膝關(guān)節(jié)滑液中NK、CD38亞

10、群、及NK細胞表面趨化因子受體(CXCR3、CCR5)、顆粒酶B、穿孔素的表達。采用酶消化法分別制備10例RA新鮮滑膜組織單細胞懸液，密度梯度離心法獲得淋巴細胞，流式細胞術(shù)測定滑膜組織中NK、CD38亞群細胞比例。35例行關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)置換術(shù)RA患者和25例行關(guān)節(jié)置換術(shù)OA患者的術(shù)后石蠟包埋的滑膜組織，做CD38和CD56分子免疫組化。
　　結(jié)果:
　　1.RA患者滑液中NK細胞占淋巴細胞的比例顯著高于患者外周血，兩者間有統(tǒng)計

11、學(xué)差異（P＜0.05）。RA患者外周血中NK細胞高表達趨化因子受體CCR5和CXCR3，與正常健康人群存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，兩種趨化因子受體主要表達于CD38+NK細胞亞群。
　　2.RA患者滑液NK細胞表達顆粒酶B和穿孔素水平高于自身外周血和正常健康人群外周血(P值均小于0.05)。
　　3.RA患者外周血和滑液NK細胞上CD38分子表達水平均高于正常健康人群外周血（P值均小于0.05）。
　　4.免疫組化

12、顯示，滑膜襯里層、襯里下層浸潤的炎性細胞以及成纖維細胞均可見CD38的棕黃色陽性表達，染色強度為中等，成塊狀或均質(zhì)樣分布;CD56染色陽性細胞主要表達于血管內(nèi)及其周圍組織。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者炎癥部位（滑液、滑膜）均存在NK細胞異常浸潤。
　　2.RA患者外周血NK細胞高表達CC族趨化因子，并集中表達在CD38+NK細胞表面;而RA患者滑液NK細胞高表達顆粒酶、穿孔素。說明RA患者外周血和滑液NK細胞功能存在

13、差異，外周血NK細胞趨化能力較強，而滑液中NK細胞更具殺傷能力。
　　3.RA患者外周血和滑液NK細胞均高表達CD38分子，提示CD38分子可能參與NK細胞趨化和殺傷兩種功能的調(diào)節(jié)。
　　第三部分
　　目的:
　　研究CD38分子對RA患者外周血和滑液淋巴細胞功能的影響和調(diào)節(jié)機制。
　　方法:
　　選取6例合并單、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜積液的RA患者，配對采集患者肝素鈉抗凝新鮮外周靜脈血和膝關(guān)節(jié)滑液，梯度密度

14、離心法分離外周血和滑液淋巴細胞。
　　結(jié)果:
　　1.RA外周血和滑液NK細胞上顆粒酶B和穿孔素表達在IB4組有上升趨勢，但與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，聯(lián)合IL-2刺激后外周血淋巴細胞和滑液淋巴細胞中NK細胞顆粒酶B和穿孔素表達水平顯著提高，與空白對照組和IB4組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P值均小于0.05)。
　　2.與空白對照組相比，IB4、IL-2+IB4聯(lián)合刺激均顯著增加了外周血淋巴細胞和滑液淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-

15、6和TNF-α的分泌量（P值均小于0.05）。IB4組和IL-2+IB4聯(lián)合刺激組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.無論空白對照組和IB4組、IL-2+IB4聯(lián)合刺激組，滑液NK細胞上顆粒酶B和穿孔素的表達水平均顯著高于外周血NK細胞，兩者間有統(tǒng)計學(xué)差異（P值均小于0.05）;而滑液淋巴細胞與外周血淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的分泌量僅在IL-2+IB4聯(lián)合刺激組，兩者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。<

16、br>　　4.CD38-siRNA干擾處理RA外周血淋巴細胞后，RA外周血淋巴細胞內(nèi)PLC-γ1蛋白水平明顯下降，PLC-γ1條帶的灰度值低于空白對照組;而應(yīng)用IB4刺激處理后，RA外周血血淋巴細胞內(nèi)PLC-γ1蛋白的表達明顯高于空白對照組，三組間PLC-γ1條帶的灰度值均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P值均小于0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.刺激CD38分子能顯著提高RA患者外周血和滑液中淋巴細胞分泌促炎性細胞因子的能力。
　　

17、2.刺激CD38分子可增強RA患者外周血和滑液NK細胞的殺傷能力;聯(lián)合IL-2，這種增強作用顯著放大。
　　3.CD38可通過蛋白激酶C通路介導(dǎo)細胞內(nèi)蛋白磷酸化，阻斷CD38分子可降低胞內(nèi)蛋白磷酸化水平。
　　統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)值采用Mean+SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。經(jīng)0ne-Sample Kolmogorov-Smirnov Test檢測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布;兩組均數(shù)之間比較采用兩獨立樣本t檢驗或