轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株BaF3-mb15-RAE對IKDC生物學(xué)活性的影響.pdf

1、NK細(xì)胞可直接殺傷某些腫瘤和病毒感染細(xì)胞，在固有免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的作用。樹突狀細(xì)胞(DC)是激活初始T細(xì)胞、啟動特異性免疫應(yīng)答的重要抗原遞呈細(xì)胞。最近發(fā)現(xiàn)一類能夠分泌IFN-γ并具有殺傷功能的新型樹突狀細(xì)胞亞群(IKDC)，該亞群細(xì)胞既具有NK細(xì)胞的表面標(biāo)記，又具有常規(guī)DC的表面標(biāo)記，即CD3-CD19-CD11cintB220+NK1.1+CD49b+Gr(1)-。與NK細(xì)胞類似，IKDC表達(dá)活化性受體NKG2D介導(dǎo)對靶細(xì)胞的殺傷作

2、用;在腫瘤細(xì)胞的訓(xùn)化下，IKDC表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的表達(dá)增強(qiáng)，并能交叉提呈腫瘤抗原給T細(xì)胞，從而啟動抗腫瘤的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因此，在腫瘤的免疫治療中具有良好的應(yīng)用前景。但是，IKDC在小鼠體內(nèi)的含量極少，只占脾臟CD11c+細(xì)胞的1-2％（約50000個）和骨髓CD11c+細(xì)胞的2％，用直接分選法獲得的IKDC數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足過繼免疫治療所需的細(xì)胞數(shù)。本研究試圖構(gòu)建共表達(dá)小鼠Rae-1ε（NKG2D的配體）和膜表達(dá)型IL-1

3、5的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，利用該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株給IKDC提供雙重活化信號，從而達(dá)到體外刺激IKDC增殖和活化的目的。
　　第一部分:BaF3/mb(1)5/RAE轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的制備利用重疊PCR技術(shù)將小鼠CD8α基因的信號肽序列、小鼠IL-15成熟肽編碼基因以及CD8α跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的編碼基因拼接起來，獲得膜表達(dá)型的IL-15編碼基因(命名為mb15)。以pMX-pie為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增小鼠Rae-1ε基因。將Rae-1ε基因和mb

4、15基因分別插入真核表達(dá)載體pVITRO2-mcs的兩個多克隆位點中，成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pV/mb15/RAE-1ε。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pV/mb15/RAE-1ε轉(zhuǎn)染至BaF3細(xì)胞，通過潮霉素以及FACS分選后單克隆篩選的方法，獲得穩(wěn)定共表達(dá)膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的BaF3細(xì)胞株，命名為BaF3/mb15/RAE。用類似的方法獲得只表達(dá)膜型IL-15或Rae-1ε的BaF3細(xì)胞株，分別命名為BaF3/mb15和BaF3/

5、RAE。
　　第二部分:體外分析BaF3/mb15/RAE對IKDC生物學(xué)活性的影響用重組的小鼠GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞，得到成熟DC，將DC與絲裂霉素誘導(dǎo)凋亡的BaF3/mb15/RAE細(xì)胞株共培養(yǎng)7天后，檢測DC中IKDC的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BaF3/mb15/RAE細(xì)胞株刺激后，IKDC的比例出現(xiàn)明顯增高。此外，利用流式分選DC中的IKDC(CD11cintB220+NK1.1+)，將IKDC和絲裂霉素誘導(dǎo)

6、凋亡的BaF3工程細(xì)胞株按1∶1的比例共培養(yǎng)后，流式檢測IKDC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、NKG2D、FasL和TRAIL等膜表面分子的表達(dá)以及IFN-γ，的分泌情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BaF3-Rae-1ε-mIL-15細(xì)胞株刺激后，IKDC表面CD40、CD80、MHC-Ⅱ、NKG2D和FasL均出現(xiàn)不同程度的增加，尤以MHC-Ⅱ類分子的增加最為明顯。
　　總之，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定共表達(dá)膜型IL-15和Rae-