P02基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及其過(guò)表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文P02基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及其過(guò)表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響姓名：高天慧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：消化內(nèi)科指導(dǎo)教師：段芳齡2003.5.1筇州大學(xué)醫(yī)學(xué)既2003年博士研究生學(xué)位論ZP02基因的生忙c嘶^克璉及其n舞迂對(duì)軒紐瞻攤生物學(xué)1彳為的彩響DEGFP—N3P02重構(gòu)體，并將此重構(gòu)體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞系SKMC772l和正常肝細(xì)胞系L—D2中，觀察PD2過(guò)表達(dá)對(duì)】i千細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響。方法根據(jù)P02EST序

2、列3’末端的polyA結(jié)構(gòu)和“AAT從A”的加尾信號(hào)，推測(cè)P02EST帶有3’末端，并據(jù)此設(shè)計(jì)引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA5’末端的模板轉(zhuǎn)換機(jī)制(妯itchlngMechaniSIllAts、end0fR＼ATranscriPtSMART)，采用cDNA末瑞快速手r增(rapidamplificatioilofeDNAendsRACE)技術(shù)在肝細(xì)胞癌組織中擴(kuò)增P02的5’和3’末端，用TA克隆的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物連入克隆載體pTAdv中用氨芐

3、青霉素和藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)雙重篩選含插入子的陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取5個(gè)克隆，用堿裂解法提取質(zhì)粒用PCR和酶切鑒定目的片段的插入，用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用VecScreen在線軟件篩除序列兩側(cè)所帶的裁體序列和外加接頭序列用BLAST對(duì)隨機(jī)測(cè)序的j個(gè)克隆進(jìn)行序列分斤比較序列之間有否差異，并搜索由j’RACE所得的序列與已知的P02EST之間的交疊序列，從j’RACE所得的序列中去除這段重疊序列后，與已知的P02EST拼接根據(jù)Koz

4、ak規(guī)則，判定該拼接序列是否符合全長(zhǎng)cDNA的特點(diǎn)，用BLAST在Genbank中搜索P02全長(zhǎng)cbNA的同源序列，生物軟件預(yù)測(cè)P02的oRF，以及蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能、亞細(xì)胞定位和理化性質(zhì)。通過(guò)PCR的方法在P02ORF兩側(cè)添加EcoRI和BamHI的識(shí)別序列而將其定向插入帶有綠色熒光蛋白際簽的真核報(bào)告表達(dá)載體pEGFP—N3中構(gòu)成含有P02ORF插入子的重構(gòu)體pEBFP—N3P02卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，堿裂解法抽提質(zhì)粒，雙酶切和PC

5、R法鑒定目的片段的插入Sanger法測(cè)序，VecScreen和BLAST分析測(cè)序結(jié)果，鑒定目的片段的正確插入(包括插入方向、插入部位和插入序列的正確無(wú)誤)r用QIAGEN超純質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pEGFPN3P02和pEGFP—N3通過(guò)1ipofectAMINE分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系s柵c一7721和正常肝細(xì)胞系L02，在24小時(shí)內(nèi)連續(xù)轉(zhuǎn)染3次，以轉(zhuǎn)染pEGFP—N3P02的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以轉(zhuǎn)染pEGFPN3的細(xì)胞為對(duì)照組，在熒光顯微鏡下通過(guò)

6、綠色熒光標(biāo)簽觀察P02所表達(dá)蛋白在肝系細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，監(jiān)測(cè)表達(dá)效率，通過(guò)RT—PCR、MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析，比較轉(zhuǎn)染pEGFP—N3P02的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染pEGFP—N3的對(duì)照組之間的差別。結(jié)果37RACEPCR產(chǎn)物大小在400bp左右，從3’RACE引物在EST序列中的位置，至EST序列的3’末端加上通用引物的長(zhǎng)度，也在400bp左右，根據(jù)已知的P02EST序列3’末端含有加尾信號(hào)和polyA結(jié)構(gòu)，從而判定該