c-erbB2反義寡脫氧核苷酸聯(lián)合靶向納米載體用于放射性核素顯像早期診斷乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題采用硫代化學(xué)修飾和白蛋白納米粒增加反義寡脫氧核苷酸的穩(wěn)定性，避免其在體內(nèi)被核酸酶降解。 方法： 第一部分 c-erbB2 ASODN的放射性核素標(biāo)記及鑒定人工合成一段針對c-erbB2 mRNA 5’端轉(zhuǎn)錄起始位的反義寡脫氧核苷酸，及相應(yīng)正義序列、無義序列，采用化學(xué)方法連結(jié)次乙基雙半胱氨酸(EC)與寡脫氧核苷酸(ODN)，用Sep-Pak C<,18>反相柱純化EC-ODN。用SnCl<,2>和酒石酸鈉對EC-OD

2、N進(jìn)行<'99m>Tc標(biāo)記，Sephadex G25柱層析進(jìn)行純化，薄層層析測定標(biāo)記率、比活度、放射化學(xué)純度。分別測定<'99m>Tc-EC-ODN 在室溫和與新鮮人血清37℃孵育后放射化學(xué)純度的變化了解其穩(wěn)定性。將<'99m>Tc-EC-ODN與血漿蛋白37℃孵育測定其血漿蛋白結(jié)合率。將-20℃儲存的 EC-ODN 不于同時間取出進(jìn)行<'99m>Tc標(biāo)記，觀察標(biāo)記率的變化了解其穩(wěn)定性。以<'99m>Tc-EC-ASODN 與互補(bǔ)鏈結(jié)合

3、后Sep-Pak C<,18>反相柱洗脫液放射峰的變化和PAGE電泳來觀察標(biāo)記物中ASODN的活性。 第二部分靶向納米粒的制備、鑒定及其對放射性標(biāo)記寡脫氧核苷酸的包載用二次超聲乳化和溶劑揮發(fā)技術(shù)制備牛血清白蛋白納米粒(BSANP)，采用激光粒徑儀測定納米粒的粒徑和分布，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)。用化學(xué)方法連接BSANP與EGF，Sephadex G50 分離純化 EGF-BSANP，測定粒徑和分布。聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定EGF-

4、BSANP的連接情況，用<'125>Ⅰ標(biāo)記EGF測定EGF-BSANP上EGF的偶聯(lián)量，以放射性定量的方法考察EGF-BSANP與BSANP的腫瘤細(xì)胞攝取。采用包裹法對放射性標(biāo)記寡脫氧核苷酸進(jìn)行靶向納米粒包載，10％三氯乙酸沉淀后測定包載率和不同時間點(diǎn)的藥物釋放率，繪制藥物釋放曲線。紙色譜層析法測定荷<'99m>Tc-EC-ODN 靶向納米粒在室溫和血清中的放射化學(xué)純度變化來觀察<'99m>Tc-EC-ODN。的穩(wěn)定性。 第三部

5、分荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對乳腺癌細(xì)胞靶向性的體外研究 1．以MDA-MB-231 細(xì)胞作為細(xì)胞對照，觀察 SK-Br3 細(xì)胞對荷<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒和未用靶向納米粒的<'99m>Tc-ODN的攝取，計(jì)算各組相應(yīng)處理因素作用培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞攝取率。 2．計(jì)算去各組相應(yīng)處理因素后不同培養(yǎng)時間的細(xì)胞滯留率。 3．MTI 法測定<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒對 SK-Br3 細(xì)

6、胞和MDA-MB-231 細(xì)胞的活力影響。 4．RT-PCR 半定量分析荷<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒對SK-Br3 細(xì)胞c-erbB2 mRNA表達(dá)的影響。 5．Western blot測定<'99m>Tc-ODN靶向納米粒對SK-Br3 細(xì)胞c-erbB2蛋白表達(dá)的影響。 第四部分荷<'99m>Tc標(biāo)記c-erbB2 ASODN 靶向納米粒在小鼠體內(nèi)的分布及荷瘤裸鼠SPECT顯像：荷<'99m>Tc-

7、ASODN 靶向納米粒在正常小白鼠及荷人乳腺癌裸鼠的體內(nèi)分布，荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒在荷人乳腺癌裸鼠的 SPECT 顯像研究。 結(jié)果： 第一部分 c-erbB2 ASODN 的放射性核素標(biāo)記及鑒定EC-ASODN 的 <'99m>Tc 標(biāo)記率為 81.2％±7.9％，比活度為(3.1±0.7)MBq/μg。 Sephadex G25分離純化得到的第 1 放射峰即為<'99m>Tc-EC-ASO

8、DN，經(jīng)24h穩(wěn)定性分析，其放射化學(xué)純度略有降低，但24h均值大于80％。與新鮮人血清37℃孵育分析其穩(wěn)定性，經(jīng)紙層析分析測得放射化學(xué)純度4h比1h略有降低，但4h均值大于85％。 標(biāo)記物與互補(bǔ)鏈在37℃條件下與人血清孵育60min后極性下降，反義寡脫氧核苷酸與互補(bǔ)鏈雜交后經(jīng)含7mol/1尿素16％PAGE膠電泳形成清晰的兩條帶。 第二部分靶向納米粒的制備、鑒定及其對放射性標(biāo)記寡脫氧核苷酸的包載透射電鏡觀察，納米粒形態(tài)圓

9、整，大小較均勻。激光散射法測定的BSANP平均粒徑為 34nm，90％的粒徑小于38nm。EGF-BSANP平均粒徑為36nm，90％的粒徑小于39nm，粒徑比BSANP略為增大。 SDS-PAGE電泳示，BSANP樣品電泳條帶與Marker 68kDa接近，而EGF-BSANP樣品電泳條帶與Marker 75kDa接近。 3.種標(biāo)記寡脫氧核苷酸納米粒的釋藥趨勢基本相同，均表現(xiàn)為對包載藥物的緩慢釋放。 第三部分荷

10、<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對乳腺癌細(xì)胞靶向性的體外研究 1.SK-Br3 細(xì)胞對荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒的攝取率，30min為(16.92±1.91)％，60min 達(dá)峰值(21.70±2.10)％，然后逐漸下降，在240min為(7.11±2.76)％。MDA-MB-231 細(xì)胞對非靶向納米組 <'99m>Tc-ASODN 的攝取率30min為(12.27±2.76)％，60min達(dá)峰值(13.

11、19±2.34)％，在240min為(3.70±1.91)％。SK-Br3細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞的累積攝取率都隨時間而逐漸增加，但二者對<'99m>Tc-ASODN 的累積攝取率有較明顯的差異。 2.SK-Br3 細(xì)胞對荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米滯留率呈緩慢下降的趨勢，15min滯留率為(92.26±9.19)％，60min為(73.70±6.10)％，360min為(43.70±3.10)％；對荷 <'

12、99m>Tc-SODN 靶向納米組 15min 滯留率為(93.18±8.02)％，60min為(54.91±5.96)％，360min為(5.24±1.27)％；對荷<'99m>Tc-NSODN 靶向納米組 15min 滯留率為(92.62±9.50)％，60min為(54.91±5.96)％，360min為(4.91±1.88)％。<'99m>Tc-SODN和<'99m>Tc-NSODN靶向納米組呈快速下降趨勢，與<'99m>Tc-

13、ASODN靶向納米組有明顯差異。 3.MTT法檢測荷 <'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對 SK-Br3 細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞的抑制率分別為(26.5±6.4)％和(6.5±3.1)％，差異具有顯著性(P<0.01)；<'99m>Tc-ASODN對SK-Br3細(xì)胞和MDA-MB-231 細(xì)胞的抑制率分別為(14.8±3.4)％和(5.1±3.6)％，差異具有顯著性(P<0.01)。<'99m>Tc-ASODN

14、靶向納米粒和<'99m>Tc-ASODN 對 SK-Br3 細(xì)胞的抑制率差異具有顯著性(P<0.01)。 4.RT-PCR 檢測 c-erbB2 基因 mRNA 水平結(jié)果顯示：荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米組中 c-erbB2 mRNA 的表達(dá)(灰度值為60.63±3.3)，較未用靶向納米粒<'99m>Tc-ASODN組(灰度值為96.82±5.1)mRNA表達(dá)較弱，差異有顯著性(P<0.01)。 5.West

15、ern blot檢測SK-Br3細(xì)胞c-erbB2蛋白表達(dá)結(jié)果示：采用靶向納米介導(dǎo)<'99m>Tc-ASODN組對SK-Br3細(xì)胞c-erbB2蛋白的表達(dá)抑制率明顯高于未用靶向納米介導(dǎo)<'99m>Tc-ASODN組，差異有顯著性(P<0.01)。 第四部分荷<'99m>Tc標(biāo)記c-erbB2 ASODN 靶向納米粒在小鼠體內(nèi)的分布及荷瘤裸鼠SPECT顯像： 1.<'99m>Tc-ASODN 與荷<'99m>Tc-ASOD

16、N 靶向納米粒在正常小鼠體內(nèi)分布：<'99m>TC-ASODN 注射后血清除迅速，荷<'99m>TC-ASODN 靶向納米粒在血中清除較緩慢，2種標(biāo)記物在不同時間血中滯留量有明顯區(qū)別。 2.荷人乳腺癌裸鼠模型的體內(nèi)分布：荷<'99m>Tc-ASODN靶向納米粒的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐漸升高，在 2h 達(dá)峰值(瘤/血、瘤/肌肉比值分別為3.31±0.61、14.87±6.06)，后略有下降。<'99m>Tc-ASODN放射性

17、瘤/血、瘤/肌肉比值升降趨勢與荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒相似，但同一時間點(diǎn)的放射性瘤/血比值相對較低。 3.2h進(jìn)行荷人乳腺癌裸鼠SPECT靜態(tài)顯像，腫瘤部位放射性濃聚，可見到較清晰的腫瘤顯像。 結(jié)論： 本研究中 ASODN 以螯合劑EC與<'99m>Tc連接，形成的EC-ASODN其標(biāo)記率高，放化純高，比活度符合要求，與血漿蛋白結(jié)合率低，復(fù)合物穩(wěn)定。<'99m>Tc-EC-ASODN 中的 AS