類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及肺間質(zhì)病變的相關(guān)研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分： 目的：研究細(xì)胞角蛋白在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的瓜氨酸化及其表達(dá)，探討細(xì)胞角蛋白在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法： 1.收集行外科手術(shù)的12例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織，28骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織，9例因外傷而行手術(shù)的正?；颊呋そM織，常規(guī)石蠟包埋和制備組織切片。 2.采用免疫組織化學(xué)分析、雙免疫熒光標(biāo)記分析、免疫沉淀和Western blot分析方法，檢測(cè)滑膜細(xì)胞膜是

2、否存在瓜氨酸化的細(xì)胞角蛋白，探討其在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用。 (1)免疫組織化學(xué)分析：滑膜組織按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程去石蠟和再水化，組織切片經(jīng)蛋白水解酶消化預(yù)處理并用蒸餾水沖洗后，置PBS液中。然后組織切片與細(xì)胞抗角蛋白單克隆抗體AE1/AE3(Chemicon，USA)共同孵育。組織切片與第一個(gè)抗體4℃下孵育過(guò)夜，然后用PBS液洗去未反應(yīng)多余抗體。用UltraSensitiveTM S-P試劑盒行免疫組化檢測(cè)。 (2)

3、雙免疫熒光標(biāo)記分析：組織切片如前述方法處理，然后與單克隆的抗角蛋白抗體和兔的抗瓜氨酸化蛋白抗體4℃孵育12 h，在與抗MC孵育前，組織切片首先置于由試劑盒提供的修飾緩沖液中。在強(qiáng)酸環(huán)境中修飾蛋白的瓜氨酸殘基形成脲基加合物，它能確保檢出含有瓜氨酸的蛋白而對(duì)附近的氨基酸順序沒(méi)有影響。第二種抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)和Cy<'TM>5標(biāo)記的羊抗兔lgG(H+L)(Zymed，USA)，分別作用于單克隆抗體和兔多克隆抗體。

4、組織切片室溫下孵育40 min，然后用熒光顯微鏡觀(guān)察。(Nikon 50i，Japan)。 (3)免疫沉淀和Western blot分析：利用總蛋白提取試劑盒(Biochain，USA)按照說(shuō)明書(shū)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(n=5)和骨關(guān)節(jié)炎(n=5)滑膜組織總蛋白進(jìn)行純化。利用蛋白G免疫沉淀試劑盒對(duì)標(biāo)本蛋白質(zhì)中的角蛋白按照進(jìn)行免疫沉淀。蛋白樣品(5ug)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后利用Western blot儀轉(zhuǎn)至PVDF

5、膜上。 膜給予抗角蛋白或抗MC 抗體的探針標(biāo)記，并用ECL Westem Blotting參照說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。免疫信號(hào)檢測(cè)采用Typhoon high performance gel and blot imager(Amersham)系統(tǒng)。 結(jié)論：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中存在瓜氨酸化的細(xì)胞角蛋白，細(xì)胞角蛋白在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。 第二部分： 目的：探討類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺間質(zhì)纖維化的臨床特點(diǎn)、肺部

6、HRCT、肺功能、動(dòng)脈血分析的改變和血清細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和血小板源性生長(zhǎng)因子-AB(PDGF-AB)的變化規(guī)律，討論其可能的發(fā)病機(jī)制。 方法：65例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人來(lái)自我院風(fēng)濕科門(mén)診和病房，30例RA合并肺纖維化，其中男3例，女27例，平均年齡48.2±12.6歲，病程4～18年，平均病程9.7±4.8年。；35例RA無(wú)肺纖維化，其中男4

7、例，女31例，平均年齡35.4±7.5歲，病程3～14，平均病程4.5±5.3年。實(shí)驗(yàn)組病例均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1987年RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。主要觀(guān)察指標(biāo)有性別、年齡、病程、收縮壓、舒張壓、呼吸次數(shù)，休息痛、病人評(píng)價(jià)、醫(yī)生評(píng)價(jià)，晨僵時(shí)間、握力、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)指數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)指數(shù)，關(guān)節(jié)功能評(píng)價(jià)，手X線(xiàn)分期，日常生活能力(HAQ)、肺部HRCT、肺功能、動(dòng)脈血分析等。所有病人均空腹抽血5ml，分離血清，-70℃凍存，測(cè)定

8、其血清中血清細(xì)胞因子TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1)、TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)和PDGF-AB(血小板源性生長(zhǎng)因子-AB)濃度。 結(jié)論：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺間質(zhì)病變病人多項(xiàng)臨床活動(dòng)指標(biāo)較類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎無(wú)肺間質(zhì)病變病人嚴(yán)重，肺部HRCT有明顯的小葉間隔增厚、葉間胸膜肥厚、胸壁胸膜肥厚粘連、支氣管壁增厚、蜂窩肺等影像學(xué)改變；肺功能檢查RA-ILD病人主要表現(xiàn)為彌散功能下降、限制性通氣障礙，阻塞性通

9、氣障礙、小氣道功能受損和混合性肺功能障礙；動(dòng)脈血?dú)夥治隹捎械脱跹Y；血清細(xì)胞因子水平TGF-β1、TNF-α、IGF-1明顯增高(P<0.01)。 第三部分： 目的：利用百草枯誘導(dǎo)制備肺纖維化動(dòng)物模型，觀(guān)察TGF-β1在肺纖維化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，探討TGF-β1在肺纖維發(fā)病中的作用機(jī)制。 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒3天組、7天組、14天組和21天組，染毒組按5

10、0mg/kg劑量比配置百草枯懸液染毒，染毒組給予相應(yīng)劑量的百草枯溶液1ml灌胃，對(duì)照組同時(shí)給予1ml蒸餾水，實(shí)驗(yàn)分3天、7天、14天和21天三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行觀(guān)察。2.各染毒組動(dòng)物均于觀(guān)察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃冰箱凍存，待檢測(cè)，分離并結(jié)扎右肺支氣管，生理鹽水2ml灌洗左肺，連箱凍存。左肺灌洗后，肺組織置-70℃冰箱凍存，制備肺組織勻漿。取右肺，部分冰鹽水續(xù)3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BAL

11、)，離心后取上清夜，與血清一起置于-70℃冰洗滌后置于由大連寶生物提供標(biāo)本存儲(chǔ)液中封存，待Real timequantitative PCR組織檢測(cè)。部分留取常規(guī)病理和電鏡標(biāo)本。死亡動(dòng)物于頻死前采血采取上述措施留取標(biāo)本。血清、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿TGF-β1的檢測(cè)參照senxiong公司試劑盒有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行3.肺組織TGF-β1采用實(shí)時(shí)熒光PCR(Real Time quantitative PCR)方法按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行。

12、 結(jié)論：百草枯誘導(dǎo)可建立典型的肺纖維化動(dòng)物模型。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1在肺纖維化形成過(guò)程中明顯升高和持續(xù)表達(dá)，提示它在肺纖維發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。 第四部分： 目的：探討Etanercept聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)急性肺損傷的治療作用。 方法：健康雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為百草枯50mg/kg誘導(dǎo)組10只、百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+甲強(qiáng)龍治療組10只，百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+Etanercept治療

13、組10只，百草枯50mg/kg誘導(dǎo)+甲強(qiáng)龍+Etanercept治療組10只，正常對(duì)照組10只，21天處死，留取標(biāo)本即可。40只誘導(dǎo)大鼠全部于第1天灌胃誘導(dǎo)1次，誘導(dǎo)方法是將20％的百草枯除草劑用蒸餾水適當(dāng)稀釋至1ml,配制終濃度分別為50mg/kg的溶液灌胃，正常對(duì)照組同時(shí)給予1ml蒸餾水灌胃。治療組于誘導(dǎo)1小時(shí)候開(kāi)始治療，方案為甲基強(qiáng)的松龍10mg/kg，稀釋后，鼠尾靜脈注射，一天一次，連用3d后改為5mg/kg，稀釋后鼠尾靜脈注射

14、，一天一次，用至第20天。腫瘤壞死因子拮抗劑0.5mg/kg，每周2次，皮下或肌肉注射，分別于誘導(dǎo)后第1d、4d、8d、11d、15d、18d給予。各組動(dòng)物均于21d觀(guān)察結(jié)束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，-70℃冰箱凍存，待檢測(cè)，分離并結(jié)扎右肺支氣管，生理鹽水2ml灌洗左肺，連續(xù)3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后取上清夜，與血清一起置于-70℃冰箱凍存。左肺灌洗后，肺組織置-70℃冰箱凍存，制

15、備肺組織勻漿。取右肺，部分冰鹽水洗滌后置于由大連寶生物提供標(biāo)本存儲(chǔ)液中封存，待Real time quantitative PCR組織檢測(cè)。部分留取常規(guī)病理和電鏡標(biāo)本。死亡動(dòng)物于頻死前采血采取上述措施留取標(biāo)本。血清、BALF、肺組織勻漿中細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1的檢測(cè)參照senxiong公司試劑盒有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行，美國(guó)R&D公司進(jìn)口分裝。 結(jié)論：Etanercept聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍能明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清、支氣管肺泡灌洗液和肺