TLR-4和IGF-1在小鼠由缺血再灌注及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心臟損害中的作用研究.pdf

1、第一部分 Toll樣受體4缺失改善小鼠心臟因缺血再灌注引起的功能不全與損傷 目的：在于應(yīng)用小鼠心臟缺血再灌注模型觀察Toll樣受體4缺失是否會對功能不全與損傷有保護作用，并進一步探討保護作用機制是否通過調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶和絲裂原激活的蛋白激酶這兩種重要調(diào)節(jié)酶并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。 材料與方法： 野生型C3H/HeN和Toll樣受體4（TLR-4）缺失C3H/HeJ小鼠購自美國JacksonLaborato

2、ry。C3H/HeJ小鼠因TLR-4的基因T1r4Lps-d發(fā)生突變，所以不表達功能性的TLR-4蛋白。小鼠麻醉后，在小動物呼吸機輔助呼吸下開胸后顯微鏡下結(jié)扎與開放左冠狀動脈前降支制作缺血再灌注模型。開胸后15分鐘缺血，然后60，120分鐘再灌注。實驗分為八組：（1）野生型C3H/HeN小鼠假手術(shù)組（n=7），（2）野生型C3H/HeN小鼠缺血再灌注60分鐘組（n=7），（3）野生型C3H/HeN小鼠缺血再灌注120分鐘組（n=7），（

3、4）野生型C3H/HeN小鼠缺血15分鐘組（n=7），（5）Toll樣受體4（TLR-4）缺失C3H/HeJ小鼠假手術(shù)組（n=7），（6）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血再灌注60分鐘組（n=7），（7）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血再灌注120分鐘組（n=7），（8）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血15分鐘組（n=7）。缺血再灌注后雙染色技術(shù)測定心梗面積。Evan’sblue染色區(qū)域，TTC染色區(qū)域和TTC未染色區(qū)域的大

4、小用ImageProPlus軟件測定。心肌細(xì)胞的凋亡使用caspase-3活性熒光測定法和TUNEL試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清促炎癥因子如腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白介素（interleukin，IL）1β和IL-6水平。絲裂原激活的蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedProteinKina

5、se，AMPK）及其下游蛋白乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoAcarboxylase，ACC），真核生物翻譯延伸因子-2（eukaryotictranslationelongationfactor-2，eEF2）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（GrowtharrestandDNAdamageinducedgene153，Gadd153），糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulatedprotein78，G

6、RP78）和肌醇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜激酶（inositol-requiringandER-to-nucleusenzyme，IRE）用免疫印跡方法來檢測。 數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組之間使用GraphPadPrism4中方差分析（ANOVA）與Newman-Keulsposthoc檢驗。P值小于0．05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 1．Toll樣受體-4缺失減小了缺血再灌注后心臟梗死的面積； 2．Toll樣受體-4缺失減少了缺血

7、再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡； 3．小鼠心臟缺血再灌注后血清中促炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6在Toll樣受體-4缺失鼠中較野生型有所減少； 4．在缺血再灌注Toll樣受體-4缺失小鼠中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的激活增強； 5．在缺血再灌注Toll樣受體-4缺失小鼠中其絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的變化有不同； 6．與野生型相比Toll樣受體-4缺失減輕了因缺血再灌注引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

8、 第二部分 心臟特異性過表達胰島素樣生長因子1減輕由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠心功能不全和應(yīng)激信號的激活 目的：應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)的小鼠敗血癥模型研究胰島素樣生長因子1在心肌細(xì)胞收縮功能，胞內(nèi)Ca2+處理功能，應(yīng)激信號的作用及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用機制。 材料與方法： 年齡（16-20周）與體重（20-25克）配對的雄性FVB與心臟特異性過表達胰島素樣生長因子1（IGF-1）小鼠用于此實驗。IGF-1轉(zhuǎn)基因小鼠由紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院P

9、ieroAnversa博士惠贈。實驗分為四組：FVB小鼠對照組（以下文中簡寫為FVB），F(xiàn)VB小鼠脂多糖處理組（FVB-LPS），IGF-1轉(zhuǎn)基因小鼠對照組（IGF-1）和IGF-1小鼠脂多糖處理組（IGF-1-LPS）。處理組小鼠腹腔注射在消毒生理鹽水中溶解的EscherichiaColi脂多糖（Sigma，USA）根據(jù)已發(fā)表的文獻選擇劑量與時間，劑量為4mg/kg，處理時間為6小時，6小時后處死小鼠，繼續(xù)進行下列相關(guān)實驗。根據(jù)試劑盒

10、說明應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清中IGF-1水平。 在Langendorff系統(tǒng)應(yīng)用LiberaseBlendzyme4酶（Sigma，USA）消化分離單個心肌細(xì)胞。單個心肌細(xì)胞的存活率為70％左右，選擇外形邊緣清楚收縮自如的單心肌細(xì)胞做為觀察對象。將低于致死劑量的EscherichiaColi脂多糖（1μg/ml）與外源性重組IGF-1（50nM）加入或不加入分離好的FVB單心肌細(xì)胞進行體外實驗。 使用

11、SoftEdgeMyoCamsystem（IonOptixCorporation，Miltoa，MA，USA）系統(tǒng)評估單個心肌細(xì)胞的收縮和舒張功能。AnIonOptixSoitEdgesoftware軟件適用于捕獲心肌細(xì)胞在收縮和舒張時長度的變化。細(xì)胞收縮和舒張通過下列指標(biāo)進行評估：收縮峰值（peakshortening，PS）代表細(xì)胞收縮時縮短的幅度；最大收縮和舒張速率積分（±dL/dt）代表細(xì)胞收縮和舒張的最大速率；到達收縮峰值的時

12、間（timetoPS，TPs）代表細(xì)胞收縮時程；90％舒張時間（timeto90％relengthening，TR90）代表細(xì)胞舒張到90％的時程（選擇90％而非100％是為了避免收縮時雜亂信號的干擾）。 用fura-2/AM（0．5μM）將心肌細(xì)胞固定15分鐘，然后用雙激發(fā)熒光光電系統(tǒng)（Ionoptix）進行熒光標(biāo)記。然后將心肌細(xì)胞放到奧林巴斯IX-70倒置顯微鏡，在40倍油鏡下觀察圖像。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化通過在360/

13、380兩個波長下fura-2熒光強度（fura-2fluorescenceintensity，F(xiàn)FI）比來推斷；熒光延遲時間用細(xì)胞內(nèi)Ca2+的清除率來衡量，如適合程序的單指數(shù)（single-exponential）曲線或雙指數(shù)（bi-exponential）曲線。 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生的測定是通過分析細(xì)胞內(nèi)5-甲基-2’，7-二氫熒光素雙乙酸鈉的氧化所造成的熒光素強度的變化來推斷的。用蛋白羰基含量實驗來檢測蛋白的損傷。心

14、肌細(xì)胞的凋亡使用caspase-3活性熒光測定法。 應(yīng)激信號蛋白p38，JNK和ERK及與凋亡有關(guān)蛋白Bax，Bcl-2以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的蛋白標(biāo)志物GRP78和Gadd153用免疫印跡法測定。GAPDH做為上樣控制。 數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組之間使用GraphPadPrism4中方差分析（ANOVA）與Tukeyposthoc檢驗。P值小于0．05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1．在心臟特異性IGF-1

15、過表達小鼠和FVB小鼠中急性脂多糖處理不會影響其血循環(huán)IGF-1的水平； 2．體外實驗表明IGF-1至少部分對脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+處理功能不全有改善； 3．體內(nèi)實驗表明IGF-1本身不會對小鼠心臟收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+產(chǎn)生影響，心臟特異性過表達IGF-1可減輕由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心臟收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+處理功能不全； 4．IGF-1減少由脂多糖誘導(dǎo)的活性氧簇的產(chǎn)生及蛋白損傷和心肌細(xì)胞凋