HCMV pp65特異性抗體測定在HCMV原發(fā)感染診斷中的意義及臨床應用.pdf

1、目的:明確不同病毒載量下小鼠感染狀態(tài)的差異，判斷HCMV pp65特異性抗體測定在HCMV原發(fā)感染診斷中的意義，并同時對臨床收集的擬診HCMV原發(fā)感染的89例患者血清標本和尿標本進行系統(tǒng)檢測，探討pp65抗體檢測在HCMV原發(fā)感染診斷中的作用；并由此提出原發(fā)感染的初步診斷標準，為臨床應用提供依據。 方法:(一)pp65重組蛋白為抗原(以下簡稱“pp65診斷試劑”)檢測抗體的評價：對本室血清庫中保存的確認標本，采用間接ELISA

2、法檢測其特異性IgG抗體，判斷本研究所用。pp65診斷試劑的靈敏度和準確度。 (二)小鼠模型檢測：將經空斑純化后的HCMV ADl69株通過空斑形成試驗測定病毒感染量。實驗組：每組小鼠6只，共5組，分別以1.45×106pFI.J/mlA組)、1.45×105PFU/ml(B組)、1.45×104PFU/ml(C組)、1.45×103PFI.1/ml(D組)、1.45×1 02PFIJ/ml(E組)五個不同劑量病毒懸液腹腔注射6

3、～8周齡SPF級BAI,B/e雌性小鼠，1.0ml/只：同時設立HF陰性對照組(F組)：6只，1m1同株HF細胞懸液腹腔注射6～8周齡SPF級BAI.,B/e雌性小鼠；.滅活病毒對照組(G組)：6只，1.45×106pFU/ml劑量病毒懸液56℃ 30rain滅活后腹腔注射6～8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠。各組小鼠在屏蔽系統(tǒng)中飼養(yǎng)，于接種病毒后1個月取各組小鼠進行一系列檢測，用不同的方法檢測如下指標：1.血清EIJSA檢測，采用間

4、接ELISA法檢測血清標本中HCMV pp65特異性IgM抗體，尿素變性間接ELISA法檢測pp65 IgG-AI，判斷小鼠的感染狀態(tài)。pp65 IgM抗體陽性、IgG-AI<50％則判斷為原發(fā)感染狀態(tài)。2.病毒分離：各組小鼠均取腦、肺組織勻漿接種人胚成纖維細胞(HF)細胞，觀察4～8w，檢測小鼠腦及肺組織中有無感染性病毒顆粒存在，計算其陽性率。3.PCR及RT-PCR：檢測小鼠腦及肺組織中HCMV UL83、UI,65基因及其相應的轉

5、錄產物。4.HE染色：觀察各組小鼠腦及肺組織的病理改變。同時，對本室保存的12份小鼠模型血清進行檢測，該批小鼠模型為HCMV潛伏感染后經環(huán)磷酰胺(CTX)再激活，分別檢測其pp65特異性IgM抗體和IgG-AL (三)臨床標本檢測：從臨床收集89例患者的血清和尿標本，分別以pp65診斷試劑以及HCMV全病毒為抗原，測定其特異性IgG.AI和IgM抗體，并將其與意大利DIESSE公司HCMV特異性抗體檢測試劑盒結果進行比較；尿標本常規(guī)處理

6、后接種HF細胞進行病毒分離，觀察HCMV特異性細胞病變效應(CPE)，間接免疫熒光試驗檢測細胞玻片pp65抗原，PCR-試驗檢測細胞培養(yǎng)物UL83基因。病毒分離結果同血清學方法進行比較。 結果:(一)pp65診斷試劑的評價結果：用pp65診斷試劑檢測本室保存的已確認的陽性、陰性血清特異性IgG抗體，均與原確認結果相同，提示本研究所用診斷試劑靈敏度和準確度均可達100％。 (二)小鼠模型檢測結果：A組和B組小鼠在注射病毒

7、1個月內均可表現為原發(fā)感染狀態(tài)，腦、肺組織中均檢測出感染性病毒顆粒，組織可見有明顯病理學變化；余5組各項檢測結果均未檢測到病毒感染。各項檢測結果如下：(1)血清學抗體檢測：A組和B組小鼠在注射病毒1個月后檢測pp65 IgG、IgM抗體均陽性，IgG-AI<50％；余各組小鼠在1個月檢測pp65特異性抗體均陰性，未測IgG-AL(2)病毒分離：A組和B組小鼠在1個月檢測，腦、肺組織中均可檢出感染性病毒顆粒，感染率100％：余各組檢測病毒

8、分離結果陰性。(3)PCR及RT-PCR檢測小鼠腦、肺組織中HCMV UL83、UL65基因及其相應的轉錄產物：A組和B組小鼠在1個月檢測腦、肺組織，均可檢測HCMV UL,83及ULL65 DNA，且其相應的轉錄產物亦為陽性；余各組小鼠未檢測到相關基因。(4)HE染色：A組和B組小鼠在1個月檢測，腦組織中主要表現為細胞水腫、胞質疏松、細胞層數減少等，同時可見炎性細胞浸潤；余各組小鼠檢測其腦、肺組織無明顯急性炎癥性病理改變。對12份潛伏

9、再激活的小鼠血清檢測結果顯示，其中有4份小鼠血清檢測其pp65 IgM抗體為陽性，pp65IgG均為陽性，且檢測其AI值均>60％。(三)臨床標本檢測結果：89例患者尿標本中，有5例患者尿標本病毒分離試驗的HF細胞出現CPE，PCR以及間接免疫熒光鑒定結果均為陽性。pp65診斷試劑檢測pp65 IgM抗體陽性標本共22份，陽性率為24.72％；pp65 IgG抗體陽性標本共83份，陽性率為93.26％。在檢測的83份pp65 IgG陽性

10、標本中，IgG-AI<50％17份，即原發(fā)感染率19.10％；50％、60％之間24份，即可疑原發(fā)感染率26.97％；>60％42份。HCMV全病毒為抗原檢測，IgM抗體陽性標本共25份，陽性率為28.09％；IgG，抗體陽性標本共82份，陽性率為92.13％。參比試劑盒檢測，IgM抗體陽性標本共21份，陽性率為23.59％；IgG抗體陽性標本共87份，陽性率為97.75％。統(tǒng)計學分析三種方法檢測IgG抗體結果，pp65診斷試劑與HCM

11、V全病毒為抗原檢測結果存在差異，但與參比試劑盒檢測結果比較，無明顯差異；且pp65診斷試劑檢測，靈敏度與準確度均較高。pp65診斷試劑對pp65 IgG陽性標本的AI值進行檢測，AI<60％標本共41例，陽性率為46.07％，較參比試劑IgM檢測陽性率(23.59％)高；5份明確診斷HCMV活動性感染的患者血清標本中，pp65診斷試劑與參比試劑檢測其IgG抗體，各有4份陽性，一致率為100％，‘pp65診斷試劑檢測AI值為陽性的標本有3

12、份，其中，參比試劑檢測IgM為陽性的僅有1份。 結論:(一)我們首次建立了HCMVADl69株原發(fā)感染BALB/c小鼠模型，同時采用尿素變性間接ELISA法檢測HCMV pp65 IgG-AI診斷原發(fā)感染，并由此提出原發(fā)感染模型的暫定工作定義：(1)小鼠腹腔注射病毒后飼養(yǎng)觀察1個月以內；(2)血清學檢測小鼠血清中HCMV特異性IgM抗體陽性，IgG-AI<50％：(3)在組織器官中檢測到感染性的病毒顆粒；(4)與正常對照組相比