雷帕霉素對(duì)大鼠骨髓來(lái)源樹突細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞因子分泌影響的體外研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞能夠激活初始T淋巴細(xì)胞，在器官移植的免疫反應(yīng)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用。樹突狀細(xì)胞啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的過(guò)程中細(xì)胞表面分子諸如MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86、CD54和OX-62等的表達(dá)以及細(xì)胞因子分泌的變化，會(huì)引起不同的免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞表面分子及其細(xì)胞因子分泌變化在其發(fā)揮免疫作用中起著重要作用，因?yàn)椴怀墒鞓渫患?xì)胞往往引起免疫耐受，而成熟的樹突細(xì)胞則引起免疫應(yīng)答。在樹突細(xì)胞成熟的過(guò)程中，上述細(xì)胞表面分子表達(dá)及其細(xì)胞

2、因子分泌也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。 基于樹突狀細(xì)胞獨(dú)特的功能，對(duì)樹突狀細(xì)胞生理功能的研究一直以來(lái)都是免疫學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。免疫抑制藥物大大的改善了器官移植術(shù)后病人治療效果，因此免疫抑制劑對(duì)樹突細(xì)胞生理功能的調(diào)控在免疫反應(yīng)中的作用近年來(lái)成了科學(xué)工作者新的關(guān)注熱點(diǎn)。雷帕霉素作為一種免疫抑制劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于器官移植領(lǐng)域，起初，雷帕霉素僅作為一種具有強(qiáng)大抗菌作用的抗菌藥物，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物移植模型中顯示出了強(qiáng)大的抗排斥作用，后來(lái)相關(guān)機(jī)構(gòu)批

3、準(zhǔn)其用于臨床腎移植病人。由于雷帕霉素藥理作用機(jī)制比較獨(dú)特，副作用較少，而且和其它免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，對(duì)其具體作用機(jī)制引起廣泛關(guān)注。研究表明它對(duì)T、B淋巴細(xì)胞有強(qiáng)大的免疫抑制作用，然而其對(duì)樹突細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制卻鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本課題中，我們從大鼠骨髓里面提取出樹突細(xì)胞前體細(xì)胞，在培養(yǎng)基里隔日半定量換液培養(yǎng)，選擇合適的時(shí)機(jī)加入雷帕霉素，然后分別采用流式細(xì)胞技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法觀察雷帕霉素對(duì)樹突細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞因

4、子分泌的影響。這些研究結(jié)果對(duì)于理解樹突細(xì)胞的生理功能、作用機(jī)制并為后續(xù)的移植臨床研究打下一定的基礎(chǔ)。 目的: 檢測(cè)雷帕霉素對(duì)樹突細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞因子分泌水平的影響，從而為研究樹突狀細(xì)胞生理功能，并為后續(xù)的樹突細(xì)胞回輸?shù)絼?dòng)物移植模型的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法: 取SD大鼠股骨和脛骨，無(wú)菌條件下沖洗出樹突細(xì)胞前體細(xì)胞，所得的細(xì)胞在含10％胎牛血清，GM-CSF(10ng／ml)和IL-4(5ng／ml)的R

5、PMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，采取隔日半定量換液的方法，并加入相同濃度GM-CSF、IL-4，培養(yǎng)期間用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察每組DC的形態(tài)。培養(yǎng)過(guò)程中第4天給處理組細(xì)胞加入雷帕霉素lug/ml，對(duì)照組不做任何處理。第6天對(duì)照組和處理組加入12S(1μg／ml)刺激樹突細(xì)胞成熟。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)并比較對(duì)照組和處理組間TNF-α、IL-10、IL-12和IL-6的分泌水平。收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較樹突細(xì)胞處理組和對(duì)

6、照組之間表面MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86、CD54和OX-62的表達(dá)差異。 結(jié)果: 一、雷帕霉素對(duì)DC細(xì)胞因子分泌水平的影響 收集培養(yǎng)七天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)處理組和對(duì)照組的細(xì)胞因子分泌量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明樹突細(xì)胞細(xì)胞因子TNF-α、IL-10相對(duì)分泌量較少，而IL-12p40分泌較多。在本次研究中，由于IL-6分泌量極少以至于沒(méi)有檢測(cè)出其含量。經(jīng)過(guò)雷帕霉素的預(yù)處理后，細(xì)胞因子T

7、NF-α、IL-10和工IL-12p40分泌均有所下降。 二、雷帕霉素對(duì)DC免疫表型的影響 收集培養(yǎng)七天的處理組和對(duì)照組樹突細(xì)胞，運(yùn)用流式技術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞表面分子的表達(dá)，結(jié)果表明雷帕霉素處理組和對(duì)照組表面細(xì)胞分子的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的差異。經(jīng)過(guò)雷帕霉素處理后的樹突狀細(xì)胞表面分子CD54、CD40和OX-62表達(dá)降低，而CD80、CD86和MHC Ⅱ分子的表達(dá)明顯升高。 結(jié)論: 經(jīng)過(guò)雷帕霉素預(yù)先作用的樹突細(xì)胞其