EphA-EphrinA信號(hào)系統(tǒng)在小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育中的表達(dá)與意義.pdf

1、目的:
　　研究EphA/EphrinA信號(hào)系統(tǒng)在正常小鼠的視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的表達(dá)，探討EphA/EphrinA在視覺發(fā)育過程中的意義與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞軸突生長(zhǎng)中的導(dǎo)向作用。
　　方法:
　　1.飼養(yǎng)發(fā)育正常新生C57BL/6小鼠60只，在其生長(zhǎng)至出生后第1天(P1)、第3天(P3)、第5天(P5)、第7天(P7)、第9天(P9)及4周時(shí)隨機(jī)選取小鼠10只，麻醉后在解剖顯微鏡下分離同時(shí)期的小鼠眼球20只。其中10只眼球解

2、剖后只保留其視網(wǎng)膜，另外10只保持眼球完整性。
　　2.將步驟1中分離的5只完整眼球制成石蠟切片，經(jīng)HE染色在光鏡下可見不同日齡段的小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育情況，特別是P5-P9期間小鼠視網(wǎng)膜外叢狀層的形成過程。
　　3.將步驟1中分離出的10只小鼠視網(wǎng)膜提取mRNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)EphA/EphrinA信號(hào)家族中各個(gè)亞類在視網(wǎng)膜的表達(dá)情況，篩選出表達(dá)量最高的亞類EphA4。
　　4.將步驟1中另外5只完整的小鼠眼球

3、制作成冰凍切片，用步驟3中篩選出的亞類EphA4抗體及特異性表達(dá)小鼠感光細(xì)胞和雙極細(xì)胞的Recoverin抗體，行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞軸突生長(zhǎng)情況及外叢狀層的形成過程。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育中各時(shí)期的形態(tài)變化。
　　P1-P3時(shí)期小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較為單純，內(nèi)核層及外核層尚未分出，外叢狀層未形成，感光細(xì)胞由感光前體細(xì)胞分化出，散在分布于神經(jīng)母細(xì)胞層，軸突短細(xì)，P5-P7時(shí)期視網(wǎng)膜感光細(xì)胞成

4、熟，軸突結(jié)構(gòu)趨于完整，向內(nèi)生長(zhǎng)與內(nèi)核層中新分化出的雙極細(xì)胞聯(lián)系，形成外叢狀層，至P9時(shí)期，視網(wǎng)膜的各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本穩(wěn)定，外叢狀層結(jié)構(gòu)清晰明確。
　　2.EphA/EphrinA在小鼠的視網(wǎng)膜中的表達(dá)。
　　運(yùn)用GraphPad Prism繪制出統(tǒng)計(jì)圖表顯示EphA4在小鼠視網(wǎng)膜中整體表達(dá)量最高，EphA6與EphrinA1在視網(wǎng)膜中無表達(dá)，EphA4在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素反差分析，N=3，得出均

5、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差:P1(0.48±0.33)，P3(0.55±0.23)，P5（0.76±0.11），P7(1.12±0.88)，P9(0.74±0.08)，4W（0.66±0.07），P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.不同時(shí)期小鼠視網(wǎng)膜Recoverin及EphA4表達(dá)。
　　P1至P3階段可見Recoverin表達(dá)于小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞胞膜及胞體，散在分布于神經(jīng)母細(xì)胞層，EphA4主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與內(nèi)叢狀層，P5-P

6、7可見Recoverin表達(dá)的感光細(xì)胞軸突發(fā)育成熟，外叢狀層形成，個(gè)別感光細(xì)胞散在于內(nèi)核層中表達(dá)，軸突延伸至內(nèi)核層，EphA4表達(dá)于節(jié)細(xì)胞層至內(nèi)核層，較P1-P3期表達(dá)強(qiáng)烈。P9中Recoverin強(qiáng)表達(dá)于外核層中感光細(xì)胞的胞膜、胞體及軸突上，可見感光細(xì)胞成熟形態(tài)，軸突集中至外叢狀層，外叢狀層穩(wěn)定形成，雙極細(xì)胞在內(nèi)核層初步形成，亦有Recoverin的較弱表達(dá)，EphA4在內(nèi)叢狀層及外叢狀層的表達(dá)最為強(qiáng)烈，形成兩條平行的熒光帶，而外核層