細(xì)胞珠蛋白檢測方法的建立及其在大鼠肝臟纖維化模型中的應(yīng)用.pdf

1、全世界有超過5％以上的人口患有與肝硬化相關(guān)的疾病，在許多國家，肝硬化已經(jīng)成為一種較普遍的致死病因。肝纖維化是肝硬化的前期病理階段，是肝臟受到慢性損傷時，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程。隨著對細(xì)胞生物學(xué)及生物化學(xué)的深入的研究，認(rèn)為肝纖維化的形成是慢性肝損傷過程中多種細(xì)胞密切聯(lián)系，并通過多種細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等相互作用、相互影響組成的網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控的。肝臟纖維化危害極大，由于肝組織結(jié)構(gòu)的破壞，造成門靜脈系統(tǒng)血管阻力增大，形成

2、門靜脈高壓，導(dǎo)致脾腫大、腹水生成和胃底食管靜脈曲張，有上消化道曲張靜脈破裂出血的潛在危險。而且由于肝纖維化使正常肝細(xì)胞之間的血液微循環(huán)通道因纖維組織成分的沉積而造成循環(huán)障礙，影響肝細(xì)胞的血液供應(yīng)，使因炎癥受損的肝細(xì)胞不易修復(fù)甚至加重?fù)p傷，直至功能正常的肝細(xì)胞越來越少，最后導(dǎo)致肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌。對肝纖維化的治療主要從幾點出發(fā):(1)去除病因治療。肝損傷嚴(yán)重的部位通常會產(chǎn)生纖維化，而炎癥和損傷的嚴(yán)重程度與肝纖維化成正相關(guān)，如果早一步去

3、除病因，如病毒、酒精及毒物，這是預(yù)防肝硬化最有效的治療措施。(2)抑制肝星狀細(xì)胞的激活和增生。(3)增加肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。如基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑TIMP，或使用尿激酶型纖溶酶原激活劑及其抑制劑。(4)增強(qiáng)肝細(xì)胞再生。如肝細(xì)胞生長因子(HGF)不僅能刺激肝臟再生，還能阻止肝纖維化的發(fā)生并加速其恢復(fù)。(5)干細(xì)胞治療。已有研究證實間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)能夠通過誘導(dǎo)HSC凋亡起到減輕肝纖維化作用。雖然以上藥物在治療肝硬化過程

4、中有效，但是副作用也大，如肝細(xì)胞生長因子有致腫瘤的危險，而尿激酶型纖溶酶原激活劑及其抑制劑可能會引起出血或是血栓形成。
　　 現(xiàn)在肝臟纖維化的診斷主要通過三種方法:一是病理活檢診斷，這仍然是肝臟纖維化診斷的“金”標(biāo)準(zhǔn)，作為一種創(chuàng)傷性檢查，具有明顯的局限性，具有一定的風(fēng)險，患者不易接受，很難保證一次取材能反應(yīng)肝臟的全貌，有一定的假陰性。二是血清學(xué)診斷:主要是肝臟纖維化四項（PCⅢ、LN、HA、CⅣ），基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)及其

5、抑制物(TIMP1)以及細(xì)胞因子的檢查，但是缺少肝臟特異性。三是影像學(xué)診斷:主要利用B超、CT以及MRI進(jìn)行檢查。雖然不能直接診斷肝臟纖維化，但仍有一定的使用價值。還有基于生化指標(biāo)和超聲探測肝臟彈性的Fibrotest和Fibroscan技術(shù)，可以無創(chuàng)、快速、定量估計肝臟纖維化程度，但卻無法準(zhǔn)確區(qū)分相鄰的纖維化分期，故尚不能完全取代肝活組織病理學(xué)檢查。因此急需尋找一種全新的方法或指標(biāo)來診斷肝臟纖維化。
　　 目前認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞

6、(HSC)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起主導(dǎo)作用。在各種致病因素作用下，靜止期HSC被激活并增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣母細(xì)胞，合成和分泌ECM上調(diào)，同時合成和釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使間質(zhì)膠原酶等蛋白酶活性降低，ECM降解減少，最終導(dǎo)致ECM積聚而發(fā)生肝纖維化乃至肝硬化。鑒于HSC在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的主導(dǎo)作用，大多數(shù)抗肝纖維化研究都以HSC為靶標(biāo)。Kawada等在進(jìn)行大鼠星狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究時，發(fā)現(xiàn)了一種新蛋白stell

7、ate cellactivation-assosiated protein(STAP)。該蛋白在肝星狀細(xì)胞活化的過程中有明顯的上調(diào)表達(dá)，并且只在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)，對其生化特性的研究表明它是一種內(nèi)源性的過氧化物酶，能夠分解過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，而后兩者據(jù)報道能激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝臟纖維化的形成。通過同源比對，在人的肝臟基因組中又發(fā)現(xiàn)了人源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白(human Stellate cell activation-associ

8、ated protein hSTAP)，其核苷酸序列與鼠源肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白(rat Stellate cell activation-associatedproteinrSTAP）的核苷酸序列有97％的同源性，該基因(GenBank AB057769)位于17號染色體，編碼190個氨基酸殘基。STAP目前在國際上也被命名cytoglobin(Cygb)或histoglobin，它屬于一個新發(fā)現(xiàn)的hexacoordinate glo

9、bin超家族的成員。我國學(xué)者Ruian Xu等(2006)構(gòu)建了大鼠Cygb的重組腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，以基因治療的方式，研究了大鼠Cygb對肝纖維化的治療作用，研究結(jié)果顯示，在大鼠的星狀細(xì)胞中過表達(dá)rCygb可以緩解氧化壓力，抑制肌成纖維樣母細(xì)胞的分化，同時減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉降。香港學(xué)者M(jìn)an KN(2008)在小鼠的動物實驗證實Cygb在四氯化碳引起的肝纖維化時表達(dá)量增加，并可能作為早期肝纖維化的標(biāo)志物。
　　 基于此設(shè)計了以

10、下實驗，通過建立Cygb的檢測方法檢測肝臟纖維化模型中Cygb的含量變化，探索其作為肝臟纖維化檢測指標(biāo)的可能性。
　　 Cygb的檢測建立的是雙抗夾心ELISA法。利用構(gòu)建好的工程菌制備重組人源(recombinant human Cytoglobin)細(xì)胞珠蛋白rhCygb，經(jīng)SDS-PAGE純化再回收，再經(jīng)SDS-PAGE檢測純度，并進(jìn)行Western-blot鑒定。單克隆抗體為實驗室先前制得，并用HRP標(biāo)記。雙抗夾心ELI

11、SA的方法需要對抗體進(jìn)行配對篩選，篩選出OD值最高的一對。并進(jìn)行大量制備、純化，再通過正交試驗確定抗體的包被濃度和酶標(biāo)抗體的稀釋度，以純化的rhCygb做校正抗原做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以線性范圍、準(zhǔn)確性、靈敏度評價ELISA方法。
　　 肝臟纖維化模型的構(gòu)建我們采用SD雄性大鼠皮下注射CCl4的方法，通過注射不同濃度梯度的CCl4分別構(gòu)建輕度、中度和重度肝臟纖維化模型，通過檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝臟纖維化四項(L

12、N、HA、PⅢNP、Ⅳ-C)以及病理切片確定模型的構(gòu)建。最后檢測肝纖維化各組血清Cygb含量，數(shù)據(jù)采用spss13.0處理。
　　 結(jié)果顯示，rhCygb經(jīng)純化后純度達(dá)到95％以上，可作為校正抗原。rhCygb單克隆抗體經(jīng)protein G純化，純度達(dá)到90％以上，HRP標(biāo)記率為50％-60％。配對實驗顯示以5①為包被抗體，2③為檢測抗體為最佳組合，正交試驗確定以2μg/ml包被，酶標(biāo)抗體1/1600稀釋為最佳條件，以此建立標(biāo)準(zhǔn)

13、曲線，以rhCygb濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，求得曲線方程為Y=0.3395X-0.1695，在0-1500ng具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2為99.41％，檢測限為8.7ng。大鼠肝臟纖維化模型構(gòu)建成功，病理切片顯示不同濃度CCl4能誘導(dǎo)不同程度的纖維化模型，經(jīng)Knodell指數(shù)評分顯示模型組分別為輕度、中度和重度肝臟纖維化。模型組與正常組各指標(biāo)（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶以及肝纖維化四項）有顯著性差異(P＜0.

14、05)，但中度模型組與重度模型組之間的層粘蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PⅢNP)無統(tǒng)計學(xué)差異，各模型組之間的Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)無統(tǒng)計學(xué)差異。層粘蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原（PⅢNP）與肝臟纖維化程度的相關(guān)系數(shù)分別為0.66、0.826、0.741，P值均小于0.01。而Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)與肝臟纖維化程度無相關(guān)性。正常組血清樣本中Cygb的含量為36.11±5.01ng/ml，輕度模型組血清樣本的細(xì)胞珠蛋白

15、的含量為119.11±13.00ng/ml，中度模型組血清樣本的細(xì)胞珠蛋白的含量為161.24±14.46ng/ml，重度模型組血清樣本的細(xì)胞珠蛋白的含量為203.67±29.33ng/ml。各組間兩兩比較皆有顯著性差異(P＜0.01)，細(xì)胞珠蛋白含量與肝臟纖維化程度相關(guān)系數(shù)為0.906。
　　 以上結(jié)果表明，本研究成功建立了rhCygb雙抗夾心ELISA方法，經(jīng)試驗可以成功檢測大鼠血清中Cygb;成功構(gòu)建了不同程度的肝臟纖維化