乙肝大鼠模型建立及相關(guān)肝纖維化研究.pdf

1、目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球范圍影響人類健康的重要問題，目前全球慢性乙肝感染者約有4億人。HBV慢性化進(jìn)程往往伴隨著肝纖維化的發(fā)生，肝纖維化是慢性肝炎向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段。如若活動(dòng)性肝纖維化得不到有效控制，最終約10％-30％可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。我國屬于HBV高流行區(qū)，乙肝肝纖維化是我國常見肝纖維化原因之一。目前認(rèn)為其機(jī)制歸因于肝細(xì)胞的損傷與免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在肝組織局部浸潤(rùn)。

2、持續(xù)HBV體內(nèi)復(fù)制可加速肝纖維的病理損傷，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)過度沉積。HBV具有非常嚴(yán)格的宿主特異性，自然狀態(tài)下僅感染人類及靈長(zhǎng)類動(dòng)物，由于缺乏合適的HBV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)慢性乙肝感染及該過程中發(fā)生的肝細(xì)胞損傷機(jī)制仍缺乏深入了解。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型是目前最常用的動(dòng)物模型，這種轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV基因整合在宿主染色體中，其自身處于免疫耐受狀態(tài)，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)HBV體內(nèi)的復(fù)制，但因其不形成HBV前基因組RNA復(fù)制的原始模板cccDN

3、A，同時(shí)免疫耐受也不利于觀察到小鼠肝損傷后修復(fù)反應(yīng)及肝纖維化形成。而目前實(shí)驗(yàn)用肝纖維化動(dòng)物模型多采用施以不同劑量肝毒劑化學(xué)誘導(dǎo)法建模，如四氯化碳、二甲基亞硝胺、乙醇等，還包括免疫誘導(dǎo)法、膽管阻塞法及復(fù)合方法等，這些肝纖維化動(dòng)物模型具有造模簡(jiǎn)單，成模率高，死亡率低，重復(fù)性佳等特點(diǎn)，但與我國極常見的乙肝肝纖維化發(fā)病機(jī)制相差甚遠(yuǎn)。如何建立與人HBV自然狀態(tài)感染過程類似的HBV動(dòng)物模型，是研究其發(fā)病機(jī)制及治療應(yīng)用的基礎(chǔ)，也是研究如何阻斷乙肝肝纖

4、維化進(jìn)程的關(guān)鍵。
　　重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)是臨床治療基因病常用病毒載體之一，根據(jù)AAV8亞型的高嗜肝性特點(diǎn)，本研究應(yīng)用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒載體(rAAV8-1.3HBV)經(jīng)腹腔注射法導(dǎo)入SD大鼠體內(nèi)，擬建立一種新型的模擬人類HBV感染及相關(guān)肝纖維化進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，旨在為國內(nèi)乙肝肝纖維化研究提供新視角。
　　方法:采用rA

5、AV8-1.3HBV經(jīng)腹腔注射新生SD大鼠，固定時(shí)間點(diǎn)（2周、4周、8周、12周）檢測(cè)大鼠血清及肝臟中乙肝抗原(HBsAg、HBeAg)表達(dá)及HBV DNA拷貝數(shù)，第12周處死并采集大鼠肝臟，制作病理切片行HE和Masson染色評(píng)價(jià)肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)和肝纖維化分期，免疫組化檢測(cè)乙肝核心抗原(HBcAg)陽性肝細(xì)胞的表達(dá)情況，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)等肝纖維相關(guān)因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)

6、組大鼠（0日齡，6雄7雌）腹腔注射1×1011vg的rAAV8-1.3HBV，對(duì)照組注射等體積PBS溶液。2周后采用ELISA法檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg，實(shí)驗(yàn)組雄性3820±828IU/mL，雌性3369±1581IU/mL，HBeAg分別為133±46 NCU/mL和77±71NCU/mL，乙肝抗原均為強(qiáng)陽性，感染率100％;4周、8周時(shí)血清HBsAg、HBeAg仍為陽性，但HBeAg下降趨勢(shì)較明顯;12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組HBsAg顯

7、示呈弱陽性，HBeAg基本為陰性(n=11，84.6％)，對(duì)照組乙肝抗原檢測(cè)全陰。熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠血清及肝臟HBV DNA拷貝數(shù)，2周時(shí)血清HBV DNA波動(dòng)于2.95×106至8.27×104copy/mL，個(gè)體間存在差異，總體雄性略高于雌性，隨時(shí)間變化拷貝數(shù)緩慢下降，但12周時(shí)仍維持較高拷貝數(shù);第12周檢測(cè)肝臟HBV DNA拷貝數(shù)明顯高于同期血清含量(p＜0.001)。第12周處死大鼠取肝臟做病理切片。HE染色見實(shí)驗(yàn)組普遍出

8、現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、點(diǎn)灶狀壞死及嗜酸性變，匯管區(qū)擴(kuò)大及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)炎性改變。Masson染色見匯管區(qū)周圍纖維化，有不同程度纖維間隔形成，無假小葉形成。肝臟免疫組化證實(shí)肝內(nèi)存在HBcAg陽性細(xì)胞，這直接證明了rAAV8-1.3HBV注射建模法可感染大鼠肝細(xì)胞并持續(xù)進(jìn)行HBV肝內(nèi)復(fù)制。免疫組化同時(shí)觀察到TGF-β1細(xì)胞因子的陽性表達(dá)，提示該模型已啟動(dòng)乙肝肝纖維化進(jìn)程。
　　結(jié)論:經(jīng)檢索國內(nèi)外尚無此類大鼠模型的報(bào)道。本項(xiàng)目首次利用rAAV8-