中華眼鏡蛇毒組分C體外對人膠質(zhì)瘤株的作用及機制研究.pdf

1、背景和目的: 腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，占腦惡性腫瘤的50％以上，目前腦膠質(zhì)瘤的治療，主要依賴手術(shù)切除，但是由于腦膠質(zhì)瘤浸潤性生長的特性，使得手術(shù)切除難以達到臨床治愈的目的，級別較高的腦膠質(zhì)瘤容易手術(shù)后復(fù)發(fā)或者腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。為了達到良好的治療結(jié)果，化療作為腦膠質(zhì)瘤綜合治療的一項重要手段，有著舉足輕重的作用。但是血腦屏障的存在及腦膠質(zhì)瘤對化療藥物敏感性的差異等因素，使腦膠質(zhì)瘤化療的臨床效果不能不令人滿意。 提高腦膠質(zhì)瘤的化療效

2、果方法很多，通過新藥研發(fā)、聯(lián)合用藥、局部用藥甚至個體化用藥等方法，使得腦膠質(zhì)瘤的化療效果有所提高。但是，迄今為止，腦膠質(zhì)瘤的化療效果仍然不能達到臨床上防治復(fù)發(fā)的要求。這樣，繼續(xù)研發(fā)新藥成了科研工作者的工作重點之一。為了能夠節(jié)省科研經(jīng)費及實驗周期，選擇對其他系統(tǒng)惡性腫瘤有效的化療藥物進行試驗篩選，是切實可行的辦法。中華眼鏡蛇蛇毒組分C是已知的對多種惡性腫瘤有效的一種生物制劑。本課題的設(shè)計分為體外部分和體內(nèi)部分，體外部分是用中華眼鏡蛇蛇毒組

3、分C(NajaNajaActraVenomFractionC,N.N.A.V.FC)對體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細胞株U-251的藥物毒性作用的研究，及用細胞生物學、免疫組織化學、分子生物學等方法研究該藥物對腦膠質(zhì)瘤細胞株U-251的作用機制；體內(nèi)部分是用U-251瘤株接種到裸鼠，制造皮下荷瘤模型，然后通過體內(nèi)藥物試驗，研究N.N.A.V.FC對腦膠質(zhì)瘤的作用。為腦膠質(zhì)瘤化療藥物的擴展作出探索。本文主要闡述N.N.A.V.FC在體外的藥物作用及

4、機制部分的研究。 材料和方法: 體外細胞毒性試驗： 1.實驗采用96孔板體外腦膠質(zhì)瘤細胞株U-251的培養(yǎng)，分別加入N.N.A.V.FC時，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察中華眼鏡蛇蛇毒組分C對人膠質(zhì)細胞瘤株U-251的細及其他臨床化療藥物，加入藥物后，分別培養(yǎng)24小時和28小時，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察N.N.A.V.FC對人膠質(zhì)細胞瘤株U-251的細胞毒作用、量效關(guān)系等，并觀察N.N.A.V.FC與依托泊苷、鬼臼乙叉苷、

5、衛(wèi)萌(替尼泊苷、鬼臼甲叉甙)、順鉑、卡鉑、五氟尿嘧啶等臨床化療藥物的細胞毒作用差異。 2.96孔板體外培養(yǎng)正常的腦膠質(zhì)細胞，分別加入不同濃度的N.N.A.V.FC，加入藥物后，培養(yǎng)24小時，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察N.N.A.V.FC對人正常膠質(zhì)細胞的毒性作用、量效關(guān)系等， 毒理學作用機制的研究體外24孔板培養(yǎng)的腦膠質(zhì)細胞瘤株U-251，加入不同濃度N.N.A.V.FC，形態(tài)學觀察；3ug/ml藥物濃度作用12小時后，固定

6、，以免疫組織化學檢測Fas,FasL、P53、bax/bcl2的表達；分別在3.0、4.5、15小時3個濃度點，培養(yǎng)4小時，在超凈工作臺上提取DNA，行DNALADDER實驗。 結(jié)果: 1.N.N.A.V.FC組分在濃度為1.5μg/ml時，即對傳代細胞株產(chǎn)生抑制作用，劑量越大，抑制作用越明顯，本實驗4.5ug/ml時，24h及48h的抑制率分別為57.4％和59％.24h及48hIC50分別為5.76和7.19ug/m

7、l。 2.分析比較U-251細胞系對各藥物的敏感性，對U-251的IC50，低濃度時N.N.A.V.FC的作用比替尼泊苷強(t＜0.05)；血漿峰濃度時的N.N.A.V.FC對U-251膠質(zhì)瘤細胞毒性作用強于血漿峰濃度時依托泊苷、鬼臼乙叉苷、順鉑、卡鉑、五氟尿嘧啶(P＜0.01)。 3.N.N.A.V.FC濃度與U-251膠質(zhì)瘤細胞損傷程度呈正比，N.N.A.V.FC濃度在1.5ug/ml以下，U-251膠質(zhì)瘤細胞的輪廓

8、尚清晰，細胞形態(tài)無明顯變化，胞體折光性好，細胞突起明顯，N.N.A.V.FC濃度達3ug/ml時，細胞核固縮，細胞突起減少，胞體折光性減弱，胞漿內(nèi)可見有顆粒，當N.N.A.V.FC濃度達4.5ug/ml時，U-251膠質(zhì)瘤細胞輪廓變模糊，細胞變圓離壁，突起減少，變短，胞漿內(nèi)顆粒明顯增多，部分細胞漲大破裂。 4.Fas,FasL、P53、Bcl-2/Bax均有陽性表達，其中P53陽性表達率較高。 5.DNALADDER實驗

9、中有凋亡條帶的出現(xiàn)，其中4.5ug/ml段條帶最為清晰。 結(jié)論: 1.在本實驗中，N.N.A.V.FC組分能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞株的生長，抑制作用與濃度呈正相關(guān)，與臨床膠質(zhì)瘤化療藥相比較，N.N.A.V.FC是有效的、能抑制膠質(zhì)瘤細胞生長的藥物。 2.形態(tài)學的觀察結(jié)果顯示，N.N.A.V.FC的改變，瘤細胞形態(tài)學的改變同IC50改變一致。 3.免疫組織化學結(jié)果與DNALADDER實驗證實，N.N.A.V.F