所謂肺硬化性血管瘤中的兩種主要細(xì)胞的基因表達(dá)差異及意義.pdf

1、 肺硬化性血管瘤(pulmonary sclerosing hemangioma)是由Liebow和Hulbell首先報(bào)道的肺部較為少見腫瘤，約占肺腫瘤的2—3％，最初認(rèn)為是黃色瘤或錯(cuò)構(gòu)瘤，長(zhǎng)期以來被歸類于肺的炎性假瘤范疇。隨著時(shí)間的推移，人們逐漸認(rèn)識(shí)到：肺的硬化性血管瘤并不是肺的炎性假瘤，而是一種實(shí)實(shí)在在的“良性”真性腫瘤，盡管其發(fā)病率較低，但由于臨床CT、磁共振等影像學(xué)檢查極易與肺癌相混淆，更為嚴(yán)重的是術(shù)中冰凍病理診斷又極易

2、誤診為肺腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌以及類癌等，因而手術(shù)切除常常過度，給患者造成損害，所以對(duì)該腫瘤的研究和診斷備受重視。在我們的研究中，為了區(qū)分該腫瘤并不是炎性假瘤，也為了將來能夠有一個(gè)更適合該腫瘤的名字。我們將該腫瘤稱之為“所謂的肺硬化性血管瘤”(So—called pulmonary sclerosing hemangioma，PSH)。由于該腫瘤一般呈良性臨床經(jīng)過，與其相平行的名稱還有：良性乳頭狀神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，良性肺泡細(xì)胞瘤，良性肺腺瘤

3、，錯(cuò)構(gòu)瘤等。之所以出現(xiàn)這些名稱，是因?yàn)榈侥壳盀橹筆SH的起源尚不清楚。有人認(rèn)為來源于內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等，最近還有人提出是來源于多潛能的原始呼吸道上皮細(xì)胞的觀點(diǎn)。在新版的WHO分類當(dāng)中，也只好將該腫瘤暫時(shí)放入“未定類腫瘤”當(dāng)中。有人還對(duì)該腫瘤當(dāng)中兩種主要形態(tài)不同的細(xì)胞是否為同一起源提出了質(zhì)疑，并觀察到部分腫瘤術(shù)后若干年出現(xiàn)了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。 針對(duì)PSH的分類困難、影像和病理診斷困難、起源不明、生物

4、學(xué)特性不清的特點(diǎn)，我們收集了40余例的PSH資料，利用免疫組化、激光捕獲微切割(LCM)、RT-PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和DNA測(cè)序分析等方法，對(duì)該腫瘤進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，期望找到能正確診斷該腫瘤的方法，并對(duì)其起源及生物學(xué)行為方面作以探討。 材料與方法： 1、材料 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院1995～2004年間病理診斷為PSH及手術(shù)切除病變旁正常肺組織蠟塊標(biāo)本40例。選其中17例女性，2例男性具有完整臨床資

5、料的病例進(jìn)行基因表達(dá)方面的研究。該19例當(dāng)中，12例無自覺癥狀，為體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)；7例有癥狀者分別表現(xiàn)為胸痛、咳嗽、痰中帶血。胸部X線片或胸部CT顯示均為孤立性腫塊，多位于肺的周邊，呈圓形、卵圓形高密度影，邊緣光滑，無毛刺及分葉狀改變。腫塊位于右肺11例，左肺8例。未發(fā)現(xiàn)多發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移病例。發(fā)病時(shí)間為15天至5年不等。 2、免疫組化 選用單克隆抗體細(xì)胞角蛋白(cytokeratin L，CK—L)、上皮膜抗原(epithel

6、ial membrane antigen，EMA)標(biāo)記上皮性抗原，SP—B和TTF—1標(biāo)記原始呼吸道上皮細(xì)胞或肺泡Ⅱ型細(xì)胞，波形蛋白(vimentin，VT)標(biāo)記間葉來源細(xì)胞，CD34標(biāo)記內(nèi)皮來源細(xì)胞，CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific endolase，NSE)和突觸素(synaptophysin，Syn)標(biāo)記神經(jīng)內(nèi)分泌來源的細(xì)胞以及單克隆P53抗體(D0-7)。上述即用型抗體及S-P超敏試劑盒

7、均購(gòu)自福州邁新物技術(shù)公司。將蠟塊標(biāo)本制成4μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后進(jìn)行HE和鏈菌素抗生物素蛋白—過氧化物酶(S-P法)免疫組化染色。以已知陽性組織為陽性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，無著色及陽性細(xì)胞數(shù)<5％為(-)，陽性細(xì)胞數(shù)>5％為(+)。CK—L、SP—B、Vimentin、CD34、CD68、NSE、Syn陽性表達(dá)的判斷為單純胞質(zhì)表達(dá)；EMA陽性表達(dá)的判

8、斷為膜/質(zhì)表達(dá)；TTF—1、p53陽性表達(dá)的判斷為單純核表達(dá)或核、胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)。 3、激光捕獲目的細(xì)胞、提取總RNA 取病變組織蠟塊，制成6μm連續(xù)切片，Mayer's蘇木素—伊紅染色，二甲苯透明，切片晾干，放置在激光捕獲顯微切割(lasercapture microdissection，LCM)系統(tǒng)(LM200型)的倒置顯微鏡的載物臺(tái)上。將附有一層乙烯乙酸乙烯酯薄膜(et hylenevinylacetate poly

9、mer，EVA)的扁平塑料帽緊密覆蓋在切片的表面。定位光束標(biāo)定被選細(xì)胞，發(fā)射激光束，分別捕獲PSH組織中表面立方細(xì)胞和多角形細(xì)胞。每份標(biāo)本分別捕獲5000～10000個(gè)目的細(xì)胞。按照PieoPureTM RNA Isolation Kit說明書操作提取總PdqA(Arcturus Bioscience，Mt．View，CA)。 4、RT-PCR 按照RiboAmp()HS RNA Amplification Kit說明書

10、操作。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5％瓊脂糖，100V電泳35min，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)(BioImageing System，UVP，CA)下觀察。以β—actin為內(nèi)對(duì)照。 5、DNA提取、P53基因PCR擴(kuò)增、SSCP及測(cè)序分析 將捕獲的PSH組織中表面立方細(xì)胞和多角形細(xì)胞加入預(yù)先加有50μL DNA裂解液(10 mmol/L Tris HCl，pH8.0；1 mmol/L EDTA PH8.0；1％Tw

11、een20；200 mg/L蛋白酶K)的0.5 mL離心管上。48℃水浴14 h，95℃10 min滅活蛋白酶K，—20℃保存?zhèn)溆?。分別取多角形細(xì)胞和立方細(xì)胞的DNA模板各10μL于50μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行P53基因(5～8外顯子)PCR擴(kuò)增。取6μL PCR產(chǎn)物加等量變性上樣緩沖液混勻后，100℃熱變性10 min后迅速置于冰水浴中冷卻5 min，然后上樣于10％非變性聚丙烯酰胺凝膠(49：1)中；每組均以病變旁正常肺組織作對(duì)照。

12、恒溫電泳。凝膠經(jīng)硝酸銀染色。判斷標(biāo)準(zhǔn)：待測(cè)樣品的電泳帶與正常對(duì)照的電泳帶相比，若出現(xiàn)條帶的增加、減少或位置的移動(dòng)，即說明該樣品存在著基因突變。同時(shí)取剩余的p53基因(5～8外顯子)擴(kuò)增產(chǎn)物(40μL左右)進(jìn)行測(cè)序分析(上海聯(lián)合基因測(cè)序部)。 結(jié)果： 1、組織學(xué)改變 PSH組織形態(tài)多樣，由實(shí)性區(qū)、乳頭區(qū)、血管瘤樣區(qū)和硬化區(qū)四種基本結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并有不同程度的相互移行。腫瘤細(xì)胞主要有兩種：一種是位于實(shí)性區(qū)和乳頭區(qū)內(nèi)的多

13、角形瘤細(xì)胞，胞漿淡染或嗜酸，核圓或卵圓形，有小核仁，罕見或無核分裂像。另一種是被覆在乳頭表面、血管瘤樣區(qū)間隙及實(shí)性區(qū)裂隙內(nèi)的細(xì)胞，多呈矮立方狀，形態(tài)與肺泡Ⅱ型細(xì)胞極為相似，可融合成多核巨細(xì)胞，但無異型性。間質(zhì)內(nèi)可見較多的肥大細(xì)胞和以淋巴細(xì)胞為主的各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，還可見含鐵血黃素沉積、鈣化和骨化等。多核瘤巨細(xì)胞和硬化性乳頭的出現(xiàn)，是造成診斷困難的原因之一。 2、免疫組化結(jié)果 在40例PSH標(biāo)本中，CK—L、EMA和SP—

14、B只表達(dá)在表面立方上皮細(xì)胞或?qū)嵭詤^(qū)內(nèi)陷的立方上皮細(xì)胞和血管瘤樣區(qū)的內(nèi)襯上皮細(xì)胞，而間質(zhì)多角形細(xì)胞為陰性；Vimentin則只表達(dá)于間質(zhì)的多角形細(xì)胞；TTF—1在兩種細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)；CD34只在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在兩種細(xì)胞內(nèi)均無表達(dá)；多核瘤巨細(xì)胞則表達(dá)CK—L，SP—B和TTF—1，而CD68為陰性。此外，間質(zhì)多角形細(xì)胞少量表達(dá)Syn和NSE。19例PSH組織中，3例(15.8％)標(biāo)本p53蛋白呈陽性表達(dá)，且多角形細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于表面立

15、方細(xì)胞的表達(dá)；15例(78.9％)p53蛋白呈陰性表達(dá)，其中1例標(biāo)本雖有p53蛋白呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞，但陽性細(xì)胞數(shù)≤5％。 3、RT-PCR結(jié)果 應(yīng)用LCM方法，分別提取19例PSH當(dāng)中的兩種細(xì)胞的mRNA，RT-PCR擴(kuò)增電泳后，所謂肺硬化性血管瘤組織中的兩種細(xì)胞，其基因表達(dá)有著明顯的區(qū)別，表面立方細(xì)胞有明確的CK、EMA、SP—B和TTF—1的mRNA表達(dá)，而間質(zhì)內(nèi)的多角形細(xì)胞有明確的Vimentin、Syn和TTF—

16、1的表達(dá)，同時(shí)有弱的EMA的表達(dá)。兩種細(xì)胞都未見Ch—A的表達(dá)。這一結(jié)果與免疫組化的蛋白表達(dá)結(jié)果極為相似。 4、SSCP及測(cè)序分析 SSCP法檢測(cè)19例PSH組織P53基因突變，3例(15.8％)標(biāo)本出現(xiàn)異常移動(dòng)帶，1例發(fā)生在第6外顯子上，2例發(fā)生在第7外顯子上，第5及第8外顯子未見異常；在這3例突變中，單一多角形細(xì)胞突變2例，立方細(xì)胞和多角形細(xì)胞同時(shí)突變1例。DNA測(cè)序分析結(jié)果顯示19例PSH組織中，P53基因的突變

17、率為15.8％(3/19)；單一多角形細(xì)胞突變2例，多角形細(xì)胞和立方細(xì)胞同時(shí)突變1例；1例發(fā)生在第6外顯子；2例發(fā)生在第7外顯子，第5、8外顯子未見突變；3例均為錯(cuò)義突變。 結(jié)論： 1、PSH組織當(dāng)中的多核瘤巨細(xì)胞是表面立方細(xì)胞的融合，多核瘤巨細(xì)胞和硬化性乳頭的出現(xiàn)，是造成病理診斷困難的主要原因之一。 2、PSH組織中的多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞在形態(tài)表型上的差異可能是由于所處不同的分化狀態(tài)所致，表面立方細(xì)胞趨向肺