rolC基因轉(zhuǎn)化葡萄砧木‘5BB’的研究.pdf

1、本研究以葡萄砧木‘5BB’(V.berlandieri×V.riparia)為材料，建立了葉柄不定芽離體再生的體系，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法兩種方法將rolC基因?qū)肫咸颜枘尽?BB’中，系統(tǒng)地探討了提高‘5BB’再生率和影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因子，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的主要技術(shù)參數(shù)，建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果如下： 1．以葡萄砧木‘5BB’試管苗離體葉柄為外植體誘導(dǎo)不定芽再生。研究了不同基本

2、培養(yǎng)基、外植體類型、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度組合等因素對‘5BB’再生的影響。結(jié)果表明，MS基本培養(yǎng)基為較適合的葉柄再生基本培養(yǎng)基，著生于頂端第2、3節(jié)位的葉柄為適宜的外植體，適于葉柄再生的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度組合為BA 2.5mg/L，IBA 0.05mg/L，葉柄再生頻率最高可達(dá)到43.33％。 2．以葡萄砧木‘5BB’的葉柄為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化受體，通過對GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率的分析，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。

3、實(shí)驗(yàn)表明，侵染4min、共培養(yǎng)2d、預(yù)培養(yǎng)3d，卡那霉素選擇壓2.5mg/L，頭胞霉素濃度250mg/L時(shí)可獲得40％的GUS瞬時(shí)表達(dá)率。 3、建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化葡萄砧木‘5BB’的遺傳轉(zhuǎn)化體系：莖段為適合的外植體類型，超聲波處理時(shí)間為8s，功率為100W，AS為75mg/L時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高可達(dá)40％。 4、將rolC基因轉(zhuǎn)入葡萄砧木‘5BB’中，經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和PCR擴(kuò)增檢測，初步斷定rolC