甜菜離體培養(yǎng)直接器官發(fā)生及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、甜菜是重要的糖用和飼料作物，糖用甜菜提供了全球約30﹪的食糖；飼料甜菜是家畜最佳的多汁飼料，塊根肥大，營養(yǎng)豐富。由于栽培馴化時間較短，加上它又是一種2年生的異交作物，遺傳背景狹窄，資源貧乏。特別是自交高度不親和性，往往使得優(yōu)良單株基因型很容易丟失，給優(yōu)良品種選育材料的繁殖和保存帶來了極大困難?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展給甜菜育種方法開辟了一條新途徑。然而，由于甜菜組織培養(yǎng)重復(fù)性差，愈傷組織難以誘導(dǎo)，植株再生受基因型限制，這些問題嚴重影響到植物基

2、因工程技術(shù)在甜菜育種上的實際應(yīng)用，加劇了傳統(tǒng)育種方法的局限性，導(dǎo)致我國糖甜菜與甘蔗糖競爭中處于極大劣勢；同時伴隨著多種病害的影響，導(dǎo)致種植面積大幅度減少，產(chǎn)業(yè)的發(fā)展面臨嚴峻考驗。 針對上述存在的諸多問題，本研究以甜菜六個不同品種為材料，在高頻率誘導(dǎo)多芽的基礎(chǔ)上，進行抗病基因的轉(zhuǎn)化及檢測，并分析材料在不同階段的同工酶變化，為培育新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 1用供試的六個材料，切取子葉節(jié)，接入誘導(dǎo)多芽培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)：不同品種間的多芽

3、誘導(dǎo)率差異不大，在以子葉節(jié)為外植體，對芽進行誘導(dǎo)時，不受基因型限制。 2所用卡那霉素的濃度為150mg/L，抗性不定芽分化率較高。羧芐青霉素的濃度為800mg/L時，才能有效抑制感染外植體的農(nóng)桿菌。如有返菌現(xiàn)象，可用含800mg/L羧芐青霉素的無菌水沖洗，即可抑菌，且對材料無傷害。乙酰丁香酮(AS)可誘導(dǎo)基因的活化，可提高轉(zhuǎn)化率，本試驗加入量為100mg/L。 3采用BA和NAA的激素組合，進行莖節(jié)外植體芽的誘導(dǎo)，隨著B

4、A濃度的提高，芽誘導(dǎo)率也提高，但有部分玻璃化苗的出現(xiàn)，切去葉片，留莖節(jié)，可長出正常芽。在供試品種中，51130，51132較其它品種玻璃化程度高。 4用小芽進行擴繁時，材料不受基因型限制；在用葉片和葉柄進行多芽誘導(dǎo)時，受材料基因型的限制，不同品種誘導(dǎo)率有差異。 5在生根時，加入IBA3-5mg/L，加300mg/L的羧芐青霉素，不加卡那霉素，10d左右可看到有根尖冒出，20天后根系發(fā)達。 6在對轉(zhuǎn)RF和PBVP6

5、基因的植株進行PCR檢測時，可以清楚地看到在相應(yīng)于陽性對照位置上有些轉(zhuǎn)化的甜菜植株顯示了條帶，即含有BNYVV CP和BBSV基因的PCR擴增片斷，可初步表明所轉(zhuǎn)基因存在于有陽性條帶的轉(zhuǎn)化甜菜中。 7甜菜在加入6-芐氨基嘌呤(6-BA)誘導(dǎo)直接多芽發(fā)生的過程中，POD、EST同工酶和可溶性蛋白出現(xiàn)了酶帶條數(shù)和顏色深淺的變化，推知其變化可能與控制多芽發(fā)生的代謝活動有關(guān)；遺傳轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了明顯的酶帶顏色加深和新酶帶的增加，這是否由于外