哈氏噬纖維菌CHU-344蛋白分泌機(jī)制以及CHU-1796基因功能的研究.pdf

1、21世紀(jì)人們生存發(fā)展面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)是能源危機(jī)、環(huán)境污染的問題。發(fā)展可持續(xù)的、綠色能源來代替石油等化石資源的呼聲越來越高。生物質(zhì)能是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分是木質(zhì)纖維素，對(duì)木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用逐漸受到了人們的重視。因此揭示自然界中高效的纖維素降解機(jī)制對(duì)于更好的開發(fā)利用纖維素資源具有重要意義。
　　哈氏噬纖維菌(Cytophagahutchinsonii)是好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，能快速且徹底地降解結(jié)

2、晶纖維素。哈氏噬纖維菌可能有獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制，因?yàn)槠浒獠环置谟坞x的纖維素酶也沒有纖維小體的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)在牙齦卟啉單胞菌中存在一種新型的蛋白分泌系統(tǒng)potsecretionsystem(PorSS)，主要介導(dǎo)胞外蛋白酶跨外膜的運(yùn)輸。而預(yù)測(cè)分析哈氏噬纖維菌中存在全套的por基因，暗示哈氏噬纖維菌中也存在這樣的蛋白分泌系統(tǒng)。哈氏噬纖維菌可以在瓊脂表面或者玻璃表面快速滑動(dòng)，但是并沒有鞭毛或纖毛的結(jié)構(gòu)，滑動(dòng)的機(jī)制也是未知的。哈氏噬纖維菌降

3、解纖維素時(shí)菌體有序的排列在纖維素纖維上，研究人員猜測(cè)滑動(dòng)與降解存在著某種關(guān)聯(lián)。本文主要初步探索了CHU_0344蛋白的分泌機(jī)制，并且研究了哈氏噬纖維菌中兩個(gè)por的同源基因CHU_0170和CHU_3237對(duì)CHU_0344蛋白分泌的影響，同時(shí)還對(duì)了CHU_1796的基因功能進(jìn)行了研究，進(jìn)一步研究了哈氏噬纖維菌的滑動(dòng)與降解的關(guān)系。
　　CHU_0344蛋白是哈氏噬纖維菌胞外主要的分泌蛋白之一，能特異性的吸附結(jié)晶纖維素。生物信息學(xué)分

4、析顯示其C端有一個(gè)含77aa的CTD結(jié)構(gòu)，說明其可能是經(jīng)由新型的PorSS進(jìn)行運(yùn)輸?shù)?，即為PorSS的底物蛋白。本文研究發(fā)現(xiàn)，CHU_0344蛋白在大量分泌到胞外的同時(shí)，也有一定量定位在膜上。對(duì)胞外蛋白進(jìn)行westernblot，結(jié)果顯示胞外蛋白CHU_0344蛋白不是以單一分子量的蛋白存在，而是有兩條不同分子量的蛋白條帶，分子量大小分別為60-80kDa之間以及40kDa左右。在CHU_0344缺陷株的胞外蛋白中，出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)量明顯上

5、調(diào)的蛋白:CHU_0878和CHU_1608，它們功能未知但均含有CTD結(jié)構(gòu)，可能在CHU_0344蛋白缺失后在功能上起補(bǔ)償作用。為了驗(yàn)證CTD的功能，我們對(duì)敲除CHU_0344蛋白C末端por-secre-tail的突變株△0344-pst的胞外蛋白進(jìn)行westernblot驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，CTD缺失后，胞外CHU_0344蛋白條帶消失，初步推測(cè)CTD的結(jié)構(gòu)對(duì)CHU_0344蛋白的分泌具有一定的影響。
　　哈氏噬纖維菌中存在全套的p

6、or基因，我們初步研究了在哈氏噬纖維菌中兩個(gè)por的同源基因CHU_0170(porP)以及CHU_3237(porU)對(duì)CHU_0344蛋白的分泌的影響，突變株△0170的胞外蛋白SDS-PAGE以及westernblot驗(yàn)證結(jié)果顯示CHU_0170基因的對(duì)CHU0344蛋白的分泌有一定程度的影響。△3237的胞外蛋白SDS-PAGE和westernblot結(jié)果顯示CHU_0344蛋白條帶在△3237胞外缺失，同時(shí)，在90Kda左右出

7、現(xiàn)一條信號(hào)較弱的蛋白條帶，其與CHU_0344實(shí)際預(yù)測(cè)分子量大小相符，推測(cè)為未剪切掉CTD的完整的CHU_0344蛋白。同時(shí)胞外蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，突變株中蛋白種類減少，豐度降低，缺失的蛋白多為PorSS的底物蛋白。說明，CHU_3237影響了CHU_0344蛋白分泌，同時(shí)也影響了PorSS其他底物蛋白。
　　對(duì)CHU哪1796序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，此蛋白與含有OmpA/MotB結(jié)構(gòu)域的蛋白具有較高的序列相似性。而MotB結(jié)構(gòu)域存在于鞭

8、毛的鞭毛馬達(dá)中。我們推測(cè)CHU_1796與哈氏噬纖維菌的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。通過基因敲除獲得CHU_1796的缺陷株△1796，對(duì)其進(jìn)行一系列的表型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在生長以及纖維素降解方面與野生型沒有明顯差異，但是在軟瓊脂和硬瓊脂表面的菌落擴(kuò)散能力以及在玻璃表面的個(gè)體滑動(dòng)能力均出現(xiàn)了明顯障礙。電鏡結(jié)果顯示CHU_1796也不影響菌體在纖維上的排列方式。研究表明CHU_1796是影響哈氏噬纖維菌在瓊脂表面擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)和在玻璃表面的滑動(dòng)的關(guān)鍵基因。對(duì)此基因參