哈氏噬纖維菌的Tn4351插入突變及突變子篩選與分析.pdf

1、哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是一類(lèi)廣泛分布的降解纖維素細(xì)菌，由于其能獨(dú)特的高效降解結(jié)晶纖維素而被美國(guó)能源部列入微生物基因組研究計(jì)劃，并于2005年完成了全基因組序列的測(cè)定。 哈氏噬纖維菌雖然能在貧瘠的環(huán)境中迅速?gòu)氐椎亟到饨Y(jié)晶纖維素，但是卻不易在葡萄糖碳源瓊脂平板上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件特殊，能利用的可溶性碳源范圍狹窄，所以對(duì)其纖維素降解機(jī)制的研究主要停留在表面現(xiàn)象，一直很難深入研究。本論文通過(guò)利用單獨(dú)滅菌

2、或過(guò)濾除菌的葡萄糖做碳源，降低瓊脂濃度的方法，使哈氏噬纖維菌在瓊脂平板上生長(zhǎng)條件得到改善。哈氏噬纖維菌在0.5％agar,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾或者115℃，30min高壓滅菌的葡萄糖為碳源的平板上能夠長(zhǎng)出單菌落。這為哈氏噬纖維菌的下一步研究提供了有利條件。 本論文優(yōu)化了哈氏噬纖維菌的遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)，對(duì)多個(gè)影響哈氏噬纖維菌遺傳操作的因素進(jìn)行了探索。在接合的過(guò)程中，感受態(tài)細(xì)胞的制備是一個(gè)關(guān)鍵因素，滲透壓，接合的時(shí)間和溫度都影響

3、轉(zhuǎn)化效率。以對(duì)數(shù)中期的細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞，生理鹽水或者 TC buffer 洗滌細(xì)胞，28℃接合24h，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.5×10-6左右。這種接合方式是建立在優(yōu)化了平板生長(zhǎng)條件的基礎(chǔ)上，克服了在濾紙上生長(zhǎng)的局限性，能得到大量的突變子。本論文利用轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機(jī)插入突變建立了一個(gè)突變子庫(kù)。目前大約有1000個(gè)菌株。 對(duì)纖維素的高效降解是哈氏噬纖維菌的一個(gè)明顯特征，本論文根據(jù)該菌在葡萄糖和纖維素平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象的不同，設(shè)計(jì)了一種混

4、合碳源篩選平板(0.05％GLUCOSE+1％CF-11)，根據(jù)透明圈的大小或不產(chǎn)透明圈可以篩選得到纖維素降解能力減弱或不能降解纖維素的菌株。另外發(fā)現(xiàn)0.05％葡萄糖的添加也促進(jìn)了哈氏噬纖維菌的生長(zhǎng)，該方法減少了傳統(tǒng)缺陷菌株篩選方法的煩瑣過(guò)程，提高了篩選效率。 根據(jù)是否降解纖維素，CMC酶活測(cè)定和完全降解濾紙的時(shí)間等方法發(fā)現(xiàn)兩株纖維素降解能力降低的菌株27號(hào)和31號(hào)突變子。其中27號(hào)突變子酶活降低20.7％，濾紙降解時(shí)間比哈氏噬

5、纖維菌慢一個(gè)星期左右。通過(guò)DNAMAN，BLAST等軟件對(duì)其進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)27號(hào)突變子屬于還未確定功能的蛋白的插入失活體，該蛋白在纖維素降解中是否起作用以及如何起作用，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。31號(hào)突變子酶活降低40.7％，濾紙降解時(shí)間比哈氏噬纖維菌慢13天左右。通過(guò)DNAMAN，BLAST等軟件對(duì)其進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)31號(hào)突變子屬于還未確定功能的蛋白的插入失活體，預(yù)測(cè)是一種分泌性蛋白，是否是哈氏嗜纖維菌纖維素酶系的組成部分之一還有

6、待于驗(yàn)證。 滑動(dòng)性是哈氏噬纖維菌的另一個(gè)重要特性，也是本論文篩選的突變子特性之一。 本論文篩選得到兩株滑動(dòng)性增強(qiáng)的突變子39號(hào)和212號(hào)突變子，其中39號(hào)突變子從表觀現(xiàn)象上看，CMC內(nèi)切酶活升高25.08％，從而從一方面表明哈氏噬纖維菌的多糖利用與其滑動(dòng)性相關(guān)。39號(hào)突變子屬于一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的失活突變體。其滑動(dòng)現(xiàn)象類(lèi)似于粘細(xì)菌的S型滑動(dòng)。212號(hào)突變子能夠降解濾紙。212號(hào)突變子屬于DNA解旋酶超家族I失活突變體。21