粗糙脈孢菌ncw1基因功能研究.pdf

1、生物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化的核心之一是如何將復(fù)雜的木質(zhì)纖維素降解為可發(fā)酵糖。當(dāng)前實(shí)現(xiàn)這一降解的技術(shù)瓶頸是纖維素酶的成本過高。圍繞著如何降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，有必要對(duì)重要的模式真菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）降解利用纖維素的機(jī)理進(jìn)行解析以及對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌里氏木霉（Trichoderma reesei）RL-P37進(jìn)行遺傳改造。
　　作為重要的模式真菌，粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）可以很方便地用于纖維素

2、酶的機(jī)理研究。Δncw1(NCU05137)突變體纖維素酶的表達(dá)和分泌顯著提升，本研究利用分子生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法探索了其高產(chǎn)纖維素酶的機(jī)理。首先通過搖瓶發(fā)酵和RT-qPCR確認(rèn)了該突變體能夠提高纖維素酶的表型。生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫度、剛果紅的敏感性與野生型一致，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其孢子生長(zhǎng)產(chǎn)酶和菌絲產(chǎn)酶具有一致性。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)缺失ncw1能夠引起細(xì)胞壁的變化。通過回補(bǔ)和過表達(dá)發(fā)現(xiàn)NCW1定位于成熟菌絲的隔膜，其過表達(dá)菌株與野生型表型相近。與

3、Δcre1的雜交獲得了纖維素酶進(jìn)一步提高的雙突變體，表明NCW1并不直接影響碳代謝阻遏效應(yīng);與Δ3βG雜交獲得了纖維二糖利用加快及纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)顯著提升的四突變體S22，說明NCW1與纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)及誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)途徑相關(guān)。以上結(jié)果初步闡明了ncw1在纖維素酶表達(dá)分泌過程中的作用。
　　作為纖維素酶高產(chǎn)菌株，里氏木霉(Trichoderma reesei)RL-P37被廣泛地應(yīng)用在工業(yè)蛋白的生產(chǎn)過程。從基因水平對(duì)工業(yè)菌株進(jìn)行分子

4、改造已經(jīng)成為提升工業(yè)菌株生產(chǎn)性狀的重要手段。因此，亟需構(gòu)建適用于靶向基因研究及外源蛋白表達(dá)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，特別是可用于基因無痕敲除的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。本研究以潮霉素抗性基因?yàn)闃?biāo)記，成功構(gòu)建了里氏木霉RL-P37尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并得到southern驗(yàn)證。該菌株在含有1.5mg/mL5-氟乳清酸、2mg/mL尿苷的MM培養(yǎng)基中可以正常生長(zhǎng)，并且在不含有尿苷的MM培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。此外，利用粗糙脈孢菌(Neurosporacra