天然產(chǎn)物白首烏二苯酮的神經(jīng)保護作用和兩面針堿的免疫調控作用機制研究.pdf

1、一、背景
　　 天然產(chǎn)物來源廣泛，結構多樣，藥理作用獨特，大多數(shù)都經(jīng)過長期的臨床應用，其療效確切，使用安全性高。目前有50％的臨床應用藥物來自天然產(chǎn)物及其衍生物，并且許多結構新穎的天然產(chǎn)物及其衍生物正處于臨床和臨床前研究階段。因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒易得的先導化合物成為藥物研究的熱點，天然產(chǎn)物在今后仍將是新藥的重要來源。
　　 隨著各種分離、分析和結構測定方法以及色譜、波譜聯(lián)用技術的飛速發(fā)展，化學分離和結構鑒定已經(jīng)

2、不是天然藥物研究的瓶頸。目前天然產(chǎn)物研究面臨的一個問題就在于其藥理活性和作用機制的闡述較少或研究不深，尤其是結構新穎的天然產(chǎn)物。針對合理闡釋其作用機制和結合靶標這一難點，本文第一章綜述了基因組學、蛋白質組學和計算機輔助的方法在天然產(chǎn)物靶標發(fā)現(xiàn)和機制研究中的應用，希望能夠為活性天然產(chǎn)物靶標發(fā)現(xiàn)和機制研究的方法及相關技術提供一個比較全面的認識，然后進一步將第一章的方法應用到天然產(chǎn)物cynandione A和氯化兩面針堿(nitidine c

3、hloride，后文所用兩面針堿均指氯化兩面針堿)的機制研究中，來闡明這兩個天然產(chǎn)物如何發(fā)揮相應的藥理活性。
　　 腦卒中是一種死亡率高、致殘率高的常見病、多發(fā)病，并且近幾年來發(fā)病率呈上升趨勢。缺血性腦卒中約占所有腦卒中（stroke）的80％，是指局部腦組織因血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧而發(fā)生的軟化壞死。缺血性腦卒中的病因主要是由于供應腦部血液的動脈出現(xiàn)粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導致局灶性急性腦供血不足而發(fā)病;也有因

4、異常物體（固體、液體、氣體）沿血液循環(huán)進入腦動脈或供應腦血液循環(huán)的頸部動脈，造成血流阻斷或血流量驟減而產(chǎn)生相應支配區(qū)域腦組織軟化壞死。目前臨床治療腦卒中的藥物由于其價格、抗藥性以及對出血、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)等毒副作用，應用受到了一定的限制，因此，尋找高效低毒易得的分子來防治腦卒中尤為必要。
　　 第二章介紹的天然產(chǎn)物cynandione A是從白首烏中分離得到的苯乙酮類化合物，近年來文獻報導cynandione A具有抗氧化、抗谷

5、氨酸興奮毒和胃保護等藥理活性。但目前對其作用機制尚無文獻報道，值得進一步的深入研究。
　　 多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis）至今仍是整個醫(yī)學界未解的難題之一。該病是一種慢性、自身免疫性疾病，通過破壞腦、脊髓以及視神經(jīng)的神經(jīng)纖維保護層髓磷脂，影響正常的神經(jīng)傳遞而導致身體殘疾。由于該病具有極高的復發(fā)率和致殘率，已成為常見的、重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。由于該病的發(fā)病高峰在30歲左右，因此，嚴重影響青壯年人口的工作和生

6、活質量，也給國家和政府造成極大負擔，制約社會和經(jīng)濟發(fā)展。
　　 目前臨床上對該病尚無特效治療方法，缺乏令人滿意的治療藥物。急性期主要給予糖皮質激素，復發(fā)-緩解期主要治療藥物包括:干擾素-γ，醋酸格拉替雷和單克隆抗體那他珠單抗。重度患者還可以考慮自體干細胞移植。西醫(yī)的激素療法雖然能夠緩解急性期癥狀，但毒副作用明顯，故不推薦長期使用;免疫調節(jié)劑干擾素、格爾德霉素和那他珠單抗等不僅費用昂貴，且長期使用針對單一靶點藥物容易出現(xiàn)耐受。且上

7、述藥物均需經(jīng)靜脈、或注射給藥，不能有效改善多發(fā)性硬化癥復發(fā)和髓鞘脫失等問題。因此，研制能夠有效控制多發(fā)性硬化癥的復發(fā)、改善髓鞘脫失的藥物具有重大意義。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多靶點、系統(tǒng)調節(jié)的作用特點，因此，針對防治多發(fā)性硬化癥這一復雜性、難治性疾病具有一定優(yōu)勢。
　　 第三章介紹的天然產(chǎn)物兩面針堿是從蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC]的根中分離到的具有多種藥理活性的苯駢菲啶類生物堿，是兩面針的

8、主要有效成分，是兩面針及其制劑的主要質量控制指標成分。近年來文獻報導氯化兩面針堿在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗瘧以及抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理活性、開發(fā)利用價值和應用前景?；谏鲜鲅芯窟M展，并且目前對兩面針堿的免疫調控作用尚未進行充分報道，本章首先探討了兩面針堿潛在的治療多發(fā)性硬化癥的藥理活性，進而在體外細胞模型上研究兩面針堿對不同種類和活化狀態(tài)的免疫細胞的調控作用，最后采用親和層析的方法尋找與兩面針堿存在相互作用的蛋白質以解釋其作用靶標，更

9、深一層地闡明兩面針堿的作用機制。
　　 2、目的
　　 采用文獻綜述的方法進一步研究活性天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿的作用機制，為合理開發(fā)利用天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿提供重要的科學依據(jù)，并為尋找及發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)保護和免疫調控藥物提供化學小分子模板。
　　 3、方法
　　 (1)通過清除自由基、抗氧化和抗谷氨酸興奮毒的活性篩選，發(fā)現(xiàn)活性先導物cynandione A，然后，采用

10、二維電泳和LC-MS的蛋白質組學方法研究cynandione A神經(jīng)保護作用的機制。
　　 (2)體內(nèi)實驗采用大鼠大腦中動脈缺血再灌注（缺血性腦卒中）模型，探討cynandioneA神經(jīng)保護作用及其體內(nèi)抗缺血性腦卒中損傷的機制。SD大鼠經(jīng)10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internalcarotid artery，ICA)、頸外動脈(e

11、xternal carotid artery，ECA)。結扎CCA近心端、ECA起始端后，在CCA處剪“V”形小口，沿CCA插入線栓（長40mm，直徑0.26 mm，并于20 mm長處標記），經(jīng)ICA向顱內(nèi)插至大腦中動脈分叉處，插入深度為18-20 mm。再灌注時外拉線使球端回至ECA，拔除插線，結扎ECA。假手術組除不插線外，其余步驟同手術組。大腦中動脈栓塞后2h恢復血供。通過神經(jīng)功能缺失體征評分、大鼠存活率和四氮唑法染色評價cyna

12、ndione A抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用。通過大鼠腦組織HE染色和DPYSL2、HMGB1免疫組織化學分析探討cynandione A神經(jīng)保護作用。
　　 (3)實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一種得到普遍認可和應用的多發(fā)性硬化癥實驗動物模型。造模方法是皮下注射MOG33-55并輔以CFA，通過樹突狀細胞激活體內(nèi)CD4+T細胞，產(chǎn)生Th1

13、7細胞，并使之穿過血腦屏障，攻擊自身神經(jīng)髓鞘，從而導致中樞神經(jīng)白質脫髓鞘，引起EAE。免疫當天記為第0天，于第0天和第2天給予各組小鼠腹腔注射400 ng/只百日咳毒素(PTX)。通過神經(jīng)功能評分、脊髓組織HE染色、髓鞘堿性蛋白的免疫組織化學以及血漿和組織細胞因子的水平來評價兩面針堿防治實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的作用。
　　 (4)進一步作用機制的研究是采用基因芯片、二維電泳和計算機輔助的方法推斷兩面針堿可能的作用通路。首先確

14、定合理的給藥濃度、刺激劑劑量、給藥時間和不同種類的細胞模型。分別考察兩面針堿對活化狀態(tài)下的骨髓細胞、骨髓來源的樹突狀細胞、小鼠腹腔巨噬細胞、RAW264.7巨噬細胞、脾細胞和磁珠分選的CD4+T細胞的影響。然后驗證三種方法推斷的兩面針堿調控的作用通路。
　　 (5)兩面針堿作用靶標的研究是采用生物素標記的親和層析方法。生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)系統(tǒng)常被用來尋找天然產(chǎn)物或活性小分子的靶蛋白。這種方法首先需要

15、將小分子通過連接鏈(spacer)與生物素相連，然后通過生物素與親和柱的親和力將小分子固定在親和柱上，接著在此親和柱上加入細胞提取物，與小分子有作用的蛋白就會被保留。最后，改變流動相將靶蛋白洗脫并進行功能和結構確定?；谏锼?抗生物素蛋白系統(tǒng)可以尋找靶標蛋白的性質，我們希望選擇合適的兩面針堿衍生物，通過嫁接連接臂與生物素相連獲得生物素標記的兩面針堿衍生物，將來用于尋找與兩面針堿作用的細胞內(nèi)靶標蛋白。通過pulldown實驗和weste

16、rn blot實驗證明兩面針堿與質譜鑒定到的蛋白的相互作用，再通過SPR和ITC等實驗表明此蛋白與兩面針堿確實存在相互作用，從而對下游通路產(chǎn)生影響，進一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
　　 4、結果
　　 第二章介紹了天然產(chǎn)物cynandione A的神經(jīng)保護作用機制研究。首先通過細胞水平清除自由基、抗氧化和抗谷氨酸興奮毒的活性篩選，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)保護活性先導化合物cynandione A，然后進一步采用二維電泳和LC-MS的蛋白

17、質組學方法研究其調控的蛋白質，結果分析cynandione A能夠下調DPYSL2和HMGB1蛋白的表達，并且能抑制RAF-MEK-ERK1/2通路而起到抗谷氨酸興奮毒的保護作用。體內(nèi)藥效評價發(fā)現(xiàn)該天然產(chǎn)物能夠減輕大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺失的評分，延長大鼠存活率，改善大鼠腦缺血再灌注的腦組織病理學，顯示出一定的抗腦缺血損傷的保護作用。并且組織分布證明cynandione A能夠透過血腦屏障。進一步的作用機制研究表明cynandio

18、neA是通過下調DPYSL2蛋白的表達和抑制HMGB1蛋白的截留來發(fā)揮抗腦缺血的保護作用。
　　 第三章研究了天然產(chǎn)物兩面針堿的免疫調控的作用機制和靶標。首先在整體動物水平發(fā)現(xiàn)兩面針堿腹腔內(nèi)注射能夠顯著推遲EAE發(fā)病時間并且減輕EAE的行為學評分。組織病理學考察發(fā)現(xiàn)兩面針堿能夠減少單核炎性細胞浸潤和髓鞘脫失。另外，兩面針堿顯著減少血清和組織炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平，而提高抑炎性因子IL-10水平。以上結果顯示

19、兩面針堿具有抑制小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的藥理活性。在其體內(nèi)有效的基礎上，我們篩選了腦脊髓炎發(fā)病過程中起到關鍵作用的樹突狀細胞、巨噬細胞和CD4+T細胞三類細胞，進一步研究兩面針堿對其的調控作用。通過活性篩選發(fā)現(xiàn)兩面針堿能夠促進活化的樹突狀細胞和巨噬細胞分泌IL-10，然后采用基因組學、蛋白質組學和計算機輔助手段鑒定了兩面針堿的作用通路MAPK和NF-κB，并通過實驗證明兩面針堿能夠增強活化的MAPK和NF-κB通路而促進IL-10

20、分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-10對NF-κB通路存在負反饋調節(jié)作用，從而減少炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α的分泌。另外，我們還通過采用IL-10的抗體、外源性的IL-10以及IL-10敲除實驗證明兩面針堿是通過IL-10來緩解EAE的發(fā)病。
　　 在天然產(chǎn)物兩面針堿的免疫調控的作用機制基礎上，實驗進一步采用親和層析的方法尋找與兩面針堿存在相互作用的蛋白質以解釋其作用靶標，更深一層地闡明兩面針堿的作用機制。通過pulldo

21、wn實驗和western blot實驗證明兩面針堿可與HSP90相互作用，SPR和ITC等實驗表明HSP90與兩面針堿確實存在相互作用。兩面針堿通過與HSP90結合，調控HSP90與某伴侶蛋白的相互作用，從而誘導下游通路提高IL-10的分泌，并且進一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
　　 5、結論
　　 天然產(chǎn)物cynandione A能夠下調DPYSL2和HMGB1蛋白的表達，并且能抑制RAF-MEK-ERK1/2通路而起到抗

22、谷氨酸興奮毒的保護作用。體內(nèi)藥效評價發(fā)現(xiàn)cynandione A是通過下調DPYSL2蛋白的表達和抑制HMGB1蛋白的截留來發(fā)揮抗腦缺血的保護作用。
　　 天然產(chǎn)物兩面針堿能夠增強活化的MAPK和NF-κB通路而促進IL-10分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-10對NF-κB通路存在負反饋調節(jié)作用，從而減少炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α的分泌。另外，我們還通過采用IL-10的抗體、外源性的IL-10以及IL-10敲除實驗證明兩

23、面針堿是通過IL-10來緩解EAE的發(fā)病。進一步的作用靶標研究發(fā)現(xiàn)兩面針堿與HSP90存在相互作用，并且兩面針堿通過與HSP90結合，調控HSP90與某伴侶蛋白的相互作用，從而誘導下游通路提高IL-10的分泌，并且進一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
　　 這些發(fā)現(xiàn)拓展了天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿在神經(jīng)保護和免疫調控作用的認識，進一步揭示了它們在防治缺血性腦卒中和多發(fā)性硬化癥方面的應用潛力，為尋找及發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)保護和免疫