氯化兩面針堿及Wnt通路受體FZD7在CML中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 c-Myc-microRNAs軸在氯化兩面針堿誘導(dǎo)的CML細(xì)胞紅系分化及凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　研究NC對(duì)K562細(xì)胞及原代CML細(xì)胞分化和凋亡的影響，闡明NC對(duì)c-Myc及c-Myc激活的microRNAs的影響，探討NC作為治療CML藥物的可能性。
　　研究方法:
　　1.NC對(duì)K562細(xì)胞紅系分化的影響:用不同濃度NC處理K562細(xì)胞

2、后，應(yīng)用聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)細(xì)胞的分化率.
　　2.NC對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響:用不同濃度NC處理K562細(xì)胞24或48小時(shí)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活;AnnexinⅤ/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡.
　　3.C-Myc在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用:首先應(yīng)用Western blot和real-time RT-PCR檢測(cè)NC對(duì)c-Myc蛋白和mRNA水平的影響.
　　4.NC對(duì)c-Myc降解的影響極其作用機(jī)制:我們

3、應(yīng)用Westernblot檢測(cè)NC對(duì)c-Myc Thr58磷酸化水平的影響.
　　5.C-Myc激活的microRNAs在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用:應(yīng)用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)NC處理或下調(diào)c-Myc對(duì)K562細(xì)胞中c-Myc相關(guān)microRNAs表達(dá)的影響.
　　6.NC對(duì)K562、K562/G01的IM敏感性的影響:用NC、IM或NC+IM處理K562細(xì)胞后，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察NC、IM或二者

4、聯(lián)合作用對(duì)K562集落形成能力的影響.
　　7.NC對(duì)原代CML細(xì)胞的影響:收集5例CML患者骨髓，分離單個(gè)核細(xì)胞，其中病例1-3為IM敏感型，4和5為IM耐藥型。
　　研究結(jié)果:
　　1.NC對(duì)K562細(xì)胞紅系分化的影響:應(yīng)用聯(lián)苯胺染色實(shí)驗(yàn)顯示NC可明顯增加K562細(xì)胞的分化率，且其誘導(dǎo)分化效應(yīng)具有時(shí)間、劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　2.NC對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響:MTT結(jié)果顯示NC可抑制K562的生長(zhǎng)。
　　3

5、.c-Myc在NC誘導(dǎo)的K562紅系分化及凋亡中的作用:原癌基因c-Myc通路在白血病細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)行為中起重要作用，我們發(fā)現(xiàn)NC可下調(diào)c-Myc蛋白的表達(dá)，且具有時(shí)間、劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　4.NC對(duì)c-Myc降解的影響極其作用機(jī)制:NC對(duì)c-Myc mRNA的影響不具有顯著性，由此推測(cè)NC對(duì)c-Myc的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,NC通過(guò)上調(diào)T58磷酸化加速c-Myc的降解。
　　5.c-Myc激活的micro

6、RNAs在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用:miR-17和miR-20a上調(diào)可逆轉(zhuǎn)NC誘導(dǎo)的globinγ水平升高及細(xì)胞凋亡，由此可見，NC誘導(dǎo)的K562紅系分化及凋亡是通過(guò)下調(diào)miR-17、miR-20a起作用的。
　　6.NC對(duì)K562、K562/G01對(duì)伊馬替尼的敏感性的影響:NC、IM或聯(lián)合(NC+IM)均可下調(diào)K562集落形成能力，且NC可增加IM的效力。K562/G01為伊馬替尼不敏感，但NC對(duì)仍有殺傷作用，且NC可增

7、加伊馬替尼誘導(dǎo)的K562/G01細(xì)胞凋亡。
　　7.NC對(duì)原代CML細(xì)胞的影響:NC可誘導(dǎo)原代CML細(xì)胞凋亡，并增加其對(duì)伊馬替尼敏感性，更重要的是，NC對(duì)伊馬替尼耐藥的細(xì)胞仍具有殺傷作。NC可下調(diào)原代CML細(xì)胞中c-Myc蛋白及miR-17和miR-20a的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.NC可誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化和凋亡;
　　2.NC通過(guò)增加Thr58磷酸化水平加快c-Myc的降解，并可下調(diào)c-Myc激活的mi

8、RNAs;
　　3.NC對(duì)伊馬替尼耐藥的K562/G01細(xì)胞及原代CML細(xì)胞仍有殺傷作用;
　　4.NC可能成為一個(gè)新的抗白血病藥物，為CML的治療提供新的方案及實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　第二部分 Wnt通路分子FZD7在CML中的表達(dá)及其在骨髓基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)耐藥中作用
　　研究目的:
　　研究FZD7在CML患者中的表達(dá)水平;探討FZD7異常表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞藥物敏感性及藥物誘導(dǎo)凋亡的影響;闡明FZD7在BMSCs介

9、導(dǎo)的IM耐藥中的作用，為逆轉(zhuǎn)IM多藥耐藥提供新的靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.收集16例初診未經(jīng)TKIs治療的CML患者及6例正常對(duì)照骨髓標(biāo)本，磁珠分選CD34+細(xì)胞，Real-time RT-PCR檢測(cè)CD34+細(xì)胞中10種FZD分子的表達(dá)情況。16例CML患者根據(jù)治療后情況，分為伊馬替尼敏感(imatinib sensitive，IMS)組（9例）和伊馬替尼抵抗(imatinib resistant，IMR)組（7例）

10、，分析兩組間FZD7分子的表達(dá)差異。
　　2.我們收集了3例CML（C1、C2和C3）及2例正常對(duì)照(N1和N2)骨髓標(biāo)本，體外培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞，并將其與CML細(xì)胞共培養(yǎng)后，Western blot方法檢測(cè)CML細(xì)胞中FZD7、β-catenin和MDR1的等Wnt通路分子的蛋白水平改變;Real-time RT-PCR檢測(cè)CML細(xì)胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA

11、水平的改變。
　　3.包裝攜帶FZD7 shRNA的慢病毒，感染K562細(xì)胞72小時(shí)后熒光顯微鏡觀測(cè)感染效率，用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)病毒感染后FZD7下調(diào)情況。
　　4.細(xì)胞增殖檢測(cè):MTT方法檢測(cè)FZD7下調(diào)對(duì)細(xì)胞的增殖的影響;PI染色后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FZD7對(duì)細(xì)胞周期的改變。
　　5.IM的敏感性檢測(cè):將感染后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的IM，培養(yǎng)48或

12、72小時(shí)，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)IM的敏感性，計(jì)算伊馬替尼的半數(shù)抑制濃度(IC50); AnnexinⅤ/PI雙染后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。
　　6.將感染了ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒的K562細(xì)胞與不同來(lái)源的BMSCs共培養(yǎng)48小時(shí)后，采用標(biāo)準(zhǔn)洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細(xì)胞，加入伊馬替尼(0.2μM)處理48小時(shí)，應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　7.用ShFZD7-2或S

13、hCtrl慢病毒感染K562細(xì)胞72小時(shí)后，與不同來(lái)源的BMSCs共培養(yǎng)48小時(shí)后，采用標(biāo)準(zhǔn)洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細(xì)胞，應(yīng)用Westernblot和Real-time RT-PCR檢測(cè)FZD7及Wnt下游基因的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.CML患者中FZD7表達(dá)情況:相對(duì)于正常CD34+細(xì)胞，CML CD34+細(xì)胞中FZD7表達(dá)升高。
　　2.BMSCs與CML細(xì)胞系K562及原代CML細(xì)胞直接共培養(yǎng)后

14、，K562及原代CML細(xì)胞中FZD7、β-catenin和MDR1的蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯升高，并且CML來(lái)源的BMSCs較正常對(duì)照來(lái)源的BMSCs對(duì)CML細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)激活更為顯著。此外，Real-time RT-PCR結(jié)果顯示BMSCs與CML細(xì)胞系K562共培養(yǎng)后，CML細(xì)胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA表達(dá)水平較單獨(dú)培養(yǎng)組亦明顯增高。<

15、br>　　3.包裝FZD7 shRNA慢病毒并感染K562細(xì)胞72小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察感染效率達(dá)95％以上，Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示攜帶FZD7 shRNA的慢病毒可有效下調(diào)FZD7表達(dá)。
　　4.FZD7下調(diào)抑制CML增殖:MTT結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD7干擾組的增殖速率顯著低于對(duì)照組。
　　5.FZD7下調(diào)增加CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性:MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾FZD7表達(dá)后K562細(xì)胞

16、對(duì)IM的敏感性的增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，下調(diào)FZD7后IM的誘導(dǎo)凋亡率顯著升高。Western blot結(jié)果表明FZD7干擾組caspase3及PARP-1的活性片段表達(dá)上調(diào)。
　　6.FZD7下調(diào)能減少BMSCs誘導(dǎo)的伊馬替尼耐藥:MTT結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD7下調(diào)顯著抑制BMSCs誘導(dǎo)的IM耐藥。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)的K562細(xì)胞中下調(diào)FZD7后IM的誘導(dǎo)凋亡率顯著升高。
　　7.FZD7下調(diào)能

17、減少BMSCs誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活:Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD7下調(diào)能有效逆轉(zhuǎn)BMSCs誘導(dǎo)的FZD7和MDR1蛋白上調(diào);Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD7下調(diào)能抑制BMSCs介導(dǎo)的MDR1和CD44 mRNA水平升高。由此可見，F(xiàn)ZD7高表達(dá)可能是共培養(yǎng)后Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的原因。
　　結(jié)論:
　　1.相對(duì)于正常CD34+細(xì)胞，CML CD34+