肝臟未分化胚胎性肉瘤的微衛(wèi)星雜合性缺失和miRNAs譜表達(dá)特征及其臨床病理學(xué)意義.pdf

1、[背景]
　　 1978年，Stocker和Ishak對(duì)美軍病理研究所(AFIP)收集到的一組31例具有肉瘤樣特征，并伴細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PAS染色陽(yáng)性小體的肝臟腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，51.6％的患者為6～10歲兒童，他們首次將其命名為肝臟未分化(胚胎性)肉瘤(undifferentiated(embryonal) sarcoma，UES)，現(xiàn)被世界衛(wèi)生組織(WHO)采用，也曾有人稱為肝臟惡性間葉瘤。UES是一種少見(jiàn)的，僅發(fā)生于肝臟的惡性間葉源

2、性腫瘤，免疫組化和電鏡結(jié)果支持UES是間葉細(xì)胞起源，有人推測(cè)可能來(lái)自間葉性錯(cuò)構(gòu)瘤惡變。至今全世界中英文文獻(xiàn)檢索僅報(bào)道約150例UES。UES惡性程度高，預(yù)后差，AFIP報(bào)道的UES患者的中位生存時(shí)間小于1年。到目前為止，UES多以個(gè)例臨床報(bào)道為主，還極少有單中心大例數(shù)UES組織發(fā)生和分子變異特點(diǎn)研究的報(bào)道。
　　 [目的]
　　 (1)探討單中心最大系列手術(shù)切除肝臟UES的臨床和病理學(xué)特點(diǎn)，為臨床和病理學(xué)正確診斷UES提

3、供組織病理學(xué)依據(jù)；
　　 (2)采用基因組微衛(wèi)星雜合性缺失(LOH)分析策略，探討UES的分子克隆起源特點(diǎn)，為了解UES的組織發(fā)生和分子分型提供分子病理學(xué)依據(jù)；
　　 (3)采用微小RNA(miRNAs)表達(dá)譜分析策略，篩選UES組織中高度差異表達(dá)miRNAs，通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)其作用的靶基因，進(jìn)而為開展UES靶基因功能通路和分子靶點(diǎn)的研究提供新的思路。
　　 [方法]
　　 (1)選取2000年1

4、月～2011年12月期間，在第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院行手術(shù)切除且臨床資料完整的43例UES患者，患者的性別、年齡、臨床癥狀等臨床參數(shù)來(lái)源于原始病歷記錄；UES的病理診斷按照WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)閱全部UES病例的原始住院病歷、病理報(bào)告和組織切片，對(duì)腫瘤大小、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型及免疫組化結(jié)果等進(jìn)行復(fù)片和核對(duì)。我們按照UES的組織學(xué)特點(diǎn)，將UES分成六個(gè)亞型：Ⅰ型：梭形細(xì)胞型、Ⅱ型：小細(xì)胞型、Ⅲ型：疏松水腫型、Ⅳ型：上皮樣細(xì)胞型、Ⅴ型：間

5、變細(xì)胞型、Ⅵ型：混合細(xì)胞型。通過(guò)電話和信件等方式隨訪患者的術(shù)后生存情況，隨訪時(shí)間截至到2011年12月30日。
　　 (2)根據(jù)我科實(shí)驗(yàn)室建立的多結(jié)節(jié)性肝細(xì)胞癌和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆起源特征微衛(wèi)星LOH檢測(cè)技術(shù)流程，選擇15個(gè)基因組微衛(wèi)星高頻LOH位點(diǎn)。又根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，p53基因信號(hào)通路可能參與UES的發(fā)病機(jī)制，我們選取了該通路相關(guān)基因微衛(wèi)星D12S1972(CDK4)和D9S974(CDKN2A)2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。此外，根據(jù)前期臨

6、床資料統(tǒng)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)UES在男性的發(fā)病率較高，為此，我們又選取了與雄激素受體(AR)基因相關(guān)的微衛(wèi)星DXS9736，共計(jì)18個(gè)微衛(wèi)星LOH檢測(cè)位點(diǎn)。以手術(shù)切除的18例含兩種成份且比例相當(dāng)?shù)腢ES為微衛(wèi)星LOH研究對(duì)象，通過(guò)顯微切割技術(shù)分別獲取UES瘤組織和瘤旁肝組織，經(jīng)DNA抽提和微衛(wèi)星PCR-SSCP方法檢測(cè)，按照文獻(xiàn)共識(shí)，分別以微衛(wèi)星發(fā)生LOH差異位點(diǎn)的比例<30％和≥30％作為腫瘤單克隆(UO)和多克隆(MO)起源模式的診斷標(biāo)準(zhǔn)，

7、分析不同組織學(xué)類型UES在各微衛(wèi)星LOH位點(diǎn)的分布和發(fā)生頻率上的差異特點(diǎn)，同時(shí)，分析不同克隆起源的UES與臨床病理學(xué)特點(diǎn)及手術(shù)預(yù)后等參數(shù)的相關(guān)性。
　　 (3)提取8對(duì)UES石蠟包埋組織總RNA(UES瘤組織和瘤旁組織)，用miRNAs微陣列(包含1088個(gè)miRNAs)與總RNA雜交，使用Agilent G2655AA進(jìn)行芯片掃描，F(xiàn)eature Extraction軟件讀取數(shù)據(jù)，采用Gene Spring軟件進(jìn)行差異分析。在

8、2組樣本中篩選出比正常組織表達(dá)大于2倍或小于2倍差異表達(dá)的miRNAs，采用靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行作用靶基因的預(yù)測(cè)和初步功能分析。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)臨床病理學(xué)特點(diǎn)分析顯示：本組UES以中青年男性多見(jiàn)，平均年齡35±22.49歲，<14歲和≥15歲的UES患者分別占32.6％(14/43)和67.4％(29/43)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、右上腹不適、疼痛、及腹部包塊；血清學(xué)生化檢查以堿性磷酸

9、酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶升高多見(jiàn)，影像學(xué)檢查常出現(xiàn)大小不等囊狀影或不規(guī)則無(wú)回聲區(qū)。在三個(gè)年齡段中，14歲以內(nèi)的UES患者，男女發(fā)病比例為1:1，臨床常以腹痛和腹部包塊為首發(fā)癥狀，無(wú)乙肝病毒(HBV)感染史；而在15～49歲和≥50歲的UES患者中，男女發(fā)病比例分別為11:1和14:3，以男性多見(jiàn)，臨床癥狀不典型，成年男女UES患者均常伴有HBV感染史，分別為50％(6/12)和41.18％(7/17)。在UES的六個(gè)病理亞型中，梭形細(xì)

10、胞型(Ⅰ型)預(yù)后最好(中位生存時(shí)間為15±4.2月)，上皮樣細(xì)胞型(Ⅳ型)預(yù)后最差(中位生存時(shí)間為3.0±1.0月)(P=0.018)。
　　 (2)微衛(wèi)星LOH位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示：MO型和UO型UES之間存在微衛(wèi)星LOH位點(diǎn)差異，多種瘤細(xì)胞成份的UES仍以UO型為主，占61.1％，MO型UES占38.9％。在所檢測(cè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)中，D1S507、D4S402、D8S277和DXS97364個(gè)位點(diǎn)上存在不同LOH模式的比例均超過(guò)30

11、％，其中D8S277達(dá)到42.86％。UES克隆起源方式與患者的年齡和性別有關(guān)：MO型UES患者以<14歲的男性為主，UO型UES患者以≥15歲的女性為主(P=0.040,P=0.046)；MO型UES患者的術(shù)后中位無(wú)病生存期為18.0±2.6個(gè)月，明顯優(yōu)于UO型UES患者的11.0±3.1個(gè)月(P=0.019)。
　　 (3)miRNAs基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示：共有121個(gè)miRNAs在UES組織中出現(xiàn)差異表達(dá)，其中32個(gè)miR

12、NAs表達(dá)下調(diào)，89個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)。挑選UES中下調(diào)最為顯著的miR-122、miR-192和miR-194作為靶基因預(yù)測(cè)對(duì)象，通過(guò)生物信息網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)預(yù)測(cè)出miR-122、miR-192和miR-194的共同作用靶基因是NFAT5(參與Fyn，PKA，ATM和PI3K信號(hào)通路)和DYRK1A(調(diào)控CREB、STAT3、Gli等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白激酶)。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)我國(guó)UES患者的HB

13、V感染率達(dá)到30.2％，總體發(fā)病年齡較國(guó)外UES患者要晚5～10歲左右，提示我國(guó)UES好發(fā)于中青年男性，HBV感染可能是UES重要的病因?qū)W因素之一；微衛(wèi)星LOH檢測(cè)結(jié)果顯示，雄激素受體的LOH頻率達(dá)到36.4％，提示UES的發(fā)生還可能與雄激素代謝紊亂有關(guān)。
　　 (2)UES的病理亞型、微衛(wèi)星變異特點(diǎn)、克隆起源方式與手術(shù)預(yù)后相關(guān)。梭形細(xì)胞型UES患者的預(yù)后最好，上皮樣細(xì)胞型UES患者的預(yù)后最差；MO型UES患者的手術(shù)預(yù)后明顯優(yōu)于

14、UO型UES患者，而青少年UES患者多為MO型，中老年患者多為UO型，青少年UES患者術(shù)后無(wú)病生存時(shí)間優(yōu)于老年患者，表明對(duì)UES精細(xì)的病理分型和微衛(wèi)星LOH分子分型，可為臨床判斷預(yù)后提供有價(jià)值的參考依據(jù)。
　　 (3)UES的組織發(fā)生以UO起源為主。為此，我們有理由推測(cè)，UES有可能來(lái)源于肝組織內(nèi)多潛能腫瘤干細(xì)胞。而在MO型UES中，D1S507、D4S402、D8S277和DXS97364個(gè)位點(diǎn)的LOH發(fā)生頻率最高，有可能作為

15、鑒別MO型和UO型UES的分子病理學(xué)標(biāo)志物；同時(shí)，這四個(gè)位點(diǎn)鄰近的基因分別為IBD7、USP53、DBA2和AR，為進(jìn)一步研究UES發(fā)病機(jī)制中的基因通路提供了重要線索，而青少年和中老年UES的發(fā)病機(jī)制可能存在差異。
　　 (4)UES存在特異的miRNAs差異表達(dá)譜，其中miR-122、miR-192和miR-194三種miRNAs顯著下調(diào)，有可能作為UES新型腫瘤分子標(biāo)志物，而對(duì)共同作用靶基因NFAT5和DYRK1A的深入研究