自噬在利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞及對ApoE---小鼠糖脂代謝影響的研究.pdf

1、[背景]
　　 眾所周知，糖尿病是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起的一組以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，是學(xué)術(shù)界一直難以攻克的難題。近年來研究提示，胰島β細(xì)胞功能減退和數(shù)量減少在糖尿病的發(fā)病和病程進(jìn)展中都具有重要的作用。如何保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量，已成為2型糖尿病研究中的熱點(diǎn)。胰高糖素樣多肽1（Glucagon-like peptide1，GLP-1）能根據(jù)體內(nèi)葡萄糖水平的高低，按需促進(jìn)胰島素分泌

2、，調(diào)節(jié)血糖，近年來獲得較多關(guān)注。利拉魯肽是GLP-1長效類似物，克服了天然GLP-1易被降解的特點(diǎn)，同時發(fā)揮GLP-1的多效作用，包括降糖、β細(xì)胞保護(hù)、減重、降壓、調(diào)脂全面干預(yù)多種糖尿病危險因素，且較少發(fā)生低血糖風(fēng)險，安全性好，在治療2型糖尿病及防治心血管風(fēng)險方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，但是其保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制尚不十分明確。研究表明胰島β細(xì)胞置于棕櫚酸環(huán)境中可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路，導(dǎo)致β細(xì)胞功能異常改變，機(jī)體通過自噬來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時文

3、獻(xiàn)研究中證實(shí)自噬(Autophagy)與胰島β細(xì)胞關(guān)系密切，在各個生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。自噬不但可以保護(hù)胰島β細(xì)胞免受外來因素所誘導(dǎo)的凋亡，還可以維持胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能，同時自噬還可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1-3]。因此，我們推測利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制可能與自噬的激活相關(guān)。
　　 [目的]
　　 基于上述理論，本研究以體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，闡明自噬在利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞中的作用及機(jī)制。從一個新的角度闡明了利

4、拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制，為臨床防治胰島β細(xì)胞凋亡提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1、自噬在利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　 利拉魯肽對高脂作用下胰島β細(xì)胞保護(hù)作用的研究:應(yīng)用MTT法檢測利拉魯肽對高脂作用下胰島細(xì)胞瘤系胰島細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)死亡的影響，以及AnnexinV/PI雙染法檢測INS-1細(xì)胞的凋亡情況;利拉魯肽激活胰島β細(xì)胞自噬的研究:應(yīng)用GFP-LC3轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，熒

5、光顯微鏡下觀察熒光點(diǎn)狀分布情況，Westernblot檢測蛋白LC3B和自噬相關(guān)基因ATG7、Beclin1、p62、ATG5表達(dá)的情況，并用RT-PCR法檢測相應(yīng)的基因表達(dá)，以及電鏡下觀察自噬小體形成等方式觀察利拉魯肽對INS-1細(xì)胞自噬激活的影響;利拉魯肽激活胰島β細(xì)胞自噬的機(jī)制研究:通過Westernblot檢測利拉魯肽作用下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、JNK，并用RT-PCR法檢測相應(yīng)的基因表達(dá);抑制自噬對利拉魯肽保

6、護(hù)作用的影響:自噬抑制劑（氯喹、3-MA）預(yù)先作用INS-1細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測利拉魯肽+自噬抑制劑對高脂作用下INS-1細(xì)胞死亡的影響，以及AnnexinV/PI雙染法檢測INS-1細(xì)胞的凋亡情況。
　　 2、自噬在利拉魯肽保護(hù)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠中的作用
　　 健康SPF級6周齡ApoE-/-雄性小鼠40只，隨機(jī)分為普通維持飼料喂養(yǎng)組（A:N組）、高脂飼料喂養(yǎng)組（B:HF組）、高脂飼料+利拉魯肽處理組（C:H

7、F+L組）、高脂飼料+利拉魯肽+氯喹處理組（D:HF+L+CQ組），每組10只，高脂喂養(yǎng)12周，藥物處理4周，每2周稱取體重、攝食量、攝水量。生化方法測定血清葡萄糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，放射免疫法測定游離脂肪酸(FFA)。心臟、肝臟、腎臟、下丘腦、胰臟、脂肪HE染色，光鏡下觀察各器官形態(tài)學(xué)變化。電鏡下觀察自噬小體形成。用免疫組化的方法檢測胰腺和下丘腦中GRP78、CHOP、JN

8、K3、LC3B的表達(dá)。
　　 3、自噬在利拉魯肽保護(hù)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠糖尿病模型中的作用
　　 健康SPF級6周齡ApoE-/-雄性小鼠36只，隨機(jī)分為普通維持飼料喂養(yǎng)組（A:N組）、高脂飼料喂養(yǎng)組（B:HF組）、高脂飼料+利拉魯肽處理組（C:HF+L組）、高脂飼料+利拉魯肽+氯喹處理組（D:HF+L+CQ組），每組9只，高脂喂養(yǎng)8周后，予鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)一次性腹腔造模。成功后藥

9、物處理30天，每2周稱取體重、攝食量、攝水量。生化方法測定血清葡萄糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，放射免疫法測定血清胰島素(INS)、游離脂肪酸(FFA)。肝臟、腎臟、心臟、胰臟HE染色，光鏡下觀察各器官形態(tài)學(xué)變化。電鏡下觀察自噬小體形成。用免疫組化的方法檢測胰腺和下丘腦中GRP78、CHOP、JNK3、LC3B的表達(dá)。用Westernblot方法檢測胰腺組織GRP78、CHOP蛋白表

10、達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1、自噬在利拉魯肽保護(hù)胰島β細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　 利拉魯肽+高脂組較高脂組INS-1細(xì)胞生存率增加（P＜0.05），凋亡減少;利拉魯肽處理的INS-1細(xì)胞，LC3B和p62的表達(dá)升高，ATG7、Beclin1表達(dá)降低，RT-PCR結(jié)果顯示基因表達(dá)p62升高，ATG7、Beclin1降低，電鏡下自噬小體的形成也明顯增加，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后其成點(diǎn)狀綠色熒光的數(shù)量明顯增多;利拉魯肽激活自噬的

11、機(jī)制，是通過應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。主要是利拉魯肽處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路開關(guān)GRP-78、CHOP表達(dá)降低。氯喹和3-MA應(yīng)用后，在利拉魯肽存在的情況下，利拉魯肽+氯喹+游離脂肪酸組和利拉魯肽+3-MA+游離脂肪酸組作用下INS-1細(xì)胞凋亡情況明顯高于利拉魯肽+游離脂肪酸組。利拉魯肽+氯喹+游離脂肪酸作用組和利拉魯肽+3-MA+游離脂肪酸組細(xì)胞死亡明顯增多（P＜0.05）。
　　 2、自噬在利拉魯肽保護(hù)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠

12、中的作用
　　 小鼠喂養(yǎng)12周后，與普食組相比，高脂組ApoE-/-小鼠FFA、LDL-C水平高于普通飲食組(P＜0.05)，而體重、TC、TG、FBG與普食組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。藥物干預(yù)4周后，與高脂組相比，利拉魯肽處理組ApoE-/-小鼠FBG、TC、TG、LDL、FFA都有不同程度下降，其中LDL-C、FFA顯著下降(P＜0.05)，F(xiàn)BG、TC、TG降低無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而HF+L+CQ組與高

13、脂組各項(xiàng)指標(biāo)差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在光鏡下觀察C組小鼠心臟泡沫細(xì)胞聚集減少，肝臟、腎臟脂肪沉積減輕，脂肪細(xì)胞體積減小。免疫組化胰腺C組小鼠LC3B強(qiáng)陽性表達(dá)，下丘腦C組小鼠在利拉魯肽處理后JNK3，CHOP表達(dá)下降。電鏡下，C組可見多個自噬小體。
　　 3、自噬在利拉魯肽保護(hù)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠糖尿病模型中的作用
　　 小鼠喂養(yǎng)8周后，以鏈脲佐菌素(STZ)成功造模，高脂組ApoE-/-小鼠FBG、T

14、C、LDL-C水平高于普通飲食組(P＜0.05)，體重、TG、FFA、INS等指標(biāo)變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物處理30天后發(fā)現(xiàn)，與高脂組相比，利拉魯肽處理組ApoE-/-小鼠FBG、TC、TG、LDL、FFA都有不同程度下降，其中FBG、TC、INS、TG、LDL-C均降低（P＜0.05），F(xiàn)FA變化無統(tǒng)計學(xué)意義。而HF+L+CQ組與高脂組各項(xiàng)指標(biāo)差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在光鏡下，在高脂飲食和高糖環(huán)境的刺激下，Ap

15、oE-/-小鼠出現(xiàn)明顯代謝性變化，包括形成較大面積的動脈斑塊，肝臟脂滴彌漫性浸潤、大量炎細(xì)胞浸潤，腎小球炎癥增生，脂肪細(xì)胞體積增大。在經(jīng)過利拉魯肽治療后，小鼠各個器官代謝癥狀明顯改善而同時注射自噬抑制劑的小鼠，癥狀改善不明顯。免疫組化C組小鼠下丘腦JNK3（(—)），LC3(++)。電鏡下，C組小鼠可見自噬小體形成。Westernblot檢測胰腺組織蛋白表達(dá)，可見C組GRP78、CHOP蛋白表達(dá)較B組減少。
　　 [結(jié)論]

16、>　　 經(jīng)過體外細(xì)胞高脂培養(yǎng)、體內(nèi)高脂環(huán)境和體內(nèi)糖尿病環(huán)境的作用，證實(shí)經(jīng)利拉魯肽處理后，均可產(chǎn)生自噬保護(hù)胰島β細(xì)胞，而抑制自噬后，利拉魯肽保護(hù)作用減弱或消失。在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，自噬在利拉魯肽對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用中起到關(guān)鍵作用，自噬的激活是通過應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在體內(nèi)環(huán)境中，利拉魯肽治療高脂和高糖ApoE-/-小鼠，能夠有效改善機(jī)體代謝紊亂，降低血糖和血脂水平，減輕各重要臟器脂肪沉積，使機(jī)體內(nèi)壞境回歸穩(wěn)態(tài)。本課題從一個新的角度闡明了利拉魯