利拉魯肽對肝臟糖原合成的影響及其機制的研究.pdf

1、糖尿病已經(jīng)成為全球威脅人類健康最常見的慢性病之一。2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)在糖尿病患者中占90％以上，其發(fā)病機制除胰島β細胞功能減退及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)兩個基本環(huán)節(jié)外，還包括胰腺α細胞功能異常等多個因素。傳統(tǒng)的藥物治療往往因僅局限于糖尿病發(fā)病的某一環(huán)節(jié)而療效受限。胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide1，GLP-1)具有葡萄糖依賴的

2、促胰島素分泌及抑制胰高糖素分泌的作用，既能改善β細胞功能，又有多重胰腺外的作用，能全面作用于T2DM及其并發(fā)癥發(fā)病的各個環(huán)節(jié)。近年來基于GLP-1的治療已成為T2DM治療的合理靶點。目前GLP-1在胰腺內(nèi)的作用機制研究比較充分，但其在胰腺外尤其是肝臟內(nèi)作用的分子機制尚不明確?，F(xiàn)有研究顯示GLP-1在肝臟內(nèi)以促進糖原合成為主，但具體分子機制尚無定論。本課題將通過GLP-1的長效受體激動劑利拉魯肽對肝臟糖原合成的影響及機制的研究，進一步探討

3、GLP-1及其受體激動劑在肝臟內(nèi)的作用及分子機制，為GLP-1受體激動劑在T2DM等代謝性疾病治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　一、利拉魯肽對肥胖T2DM患者β細胞功能及胰島素敏感性的影響
　　目的：探討利拉魯肽在肥胖T2DM患者中對?細胞功能及胰島素敏感性的影響。
　　方法：新診斷和口服降糖藥物效果欠佳的肥胖T2DM患者，接受二甲雙胍聯(lián)合利拉魯肽和門冬胰島素30治療共12周。測定所有對象治療前后的體重(BW)、體重指數(shù)

4、(BMI)、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2h-PG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、糖化白蛋白(GA)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、血清空腹C肽(FCP)、餐后2h C肽(2h-CP)等指標，并計算?細胞功能指數(shù)(HOMA-β)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。比較各組治療前后及兩組間各項指標變化情況。
　　結(jié)果：利拉魯肽組治療12周后BW及BMI均較治療前

5、明顯下降，與門冬胰島素30組相比存在顯著性差異。兩組治療后FPG、2h-PG、HbA1c和GA均較治療前明顯下降。利拉魯肽組治療后FCP、2h-CP和HOMA-IR較治療前明顯下降，HOMA-?明顯上升；而門冬胰島素30組治療后FCP和2h-CP較治療前明顯上升，HOMA-?也明顯上升。兩組治療后HOMA-IR下降存在顯著性差異。利拉魯肽組治療后TC、TG及LDL-C較治療前明顯下降；而門冬胰島素30組治療后TC和LDL-C較治療前明顯

6、下降。
　　結(jié)論：肥胖T2DM患者二甲雙胍聯(lián)合利拉魯肽與門冬胰島素30治療均能有效控制血糖，改善?細胞功能，且作用兩者無顯著差異。但在控制體重及改善IR方面利拉魯肽優(yōu)于門冬胰島素30，可同時改善?細胞功能和IR。提示利拉魯肽不僅存在胰腺內(nèi)的生物學(xué)作用，還存在胰腺外的生物學(xué)效應(yīng)。
　　二、利拉魯肽對HepG2細胞糖原合成信號通路的影響
　　目的：探討利拉魯肽在HepG2細胞中對糖原合成信號通路的影響。方法：以不同濃度利拉

7、魯肽(0nmol/L、0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)對HepG2細胞進行處理，12及24h后分別收集細胞，觀察處理前后細胞的形態(tài)。處理后提取細胞總mRNA并抽提細胞總蛋白。實時熒光定量PCR檢測糖原合成信號通路中Akt-2及GSK3βmRNA的表達水平。Western blot檢測糖原合成信號通路中Akt和GSK3β總蛋白及pAkt(Ser473)和pGSK3β(Ser9)磷酸化蛋白的水平。<

8、br>　　結(jié)果：HepG2細胞內(nèi)，利拉魯肽處理12小時及24小后均可上調(diào)Akt-2mRNA的表達，上調(diào)pAkt(Ser473)、Akt、pGSK3β(Ser9)蛋白水平，下調(diào)GSK3βmRNA的表達及蛋白水平，濃度為1 nmol/L時最明顯，細胞形態(tài)無明顯變化。
　　結(jié)論：在肝細胞內(nèi)，利拉魯肽可作用于PI3K/Akt/GSK3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在HepG2細胞內(nèi)最佳作用濃度為1 nmol/L，12小時已發(fā)揮作用，可持續(xù)24小時。

9、>　　三、利拉魯肽對IR及T2DM大鼠肝臟糖原合成的影響及作用機制
　　目的：探討利拉魯肽對IR及T2DM大鼠肝臟糖原合成的影響及作用機制。
　　方法：通過對高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的IR大鼠及高脂喂養(yǎng)后小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的T2DM大鼠給予利拉魯肽處理6周后分別與給予安慰劑處理的正常對照組及實驗對照組比較，檢測各組大鼠BW、血脂、FPG、空腹血清胰島素(FINS)、HOMA-β、HOMA-IR等

10、糖脂代謝指數(shù)，取肝臟組織石蠟切片行HE染色及糖原PAS染色，測定肝組織糖原含量，提取肝臟組織總mRNA并抽提肝臟組織總蛋白。實時熒光定量PCR檢測糖原合成信號通路中Akt-2及GSK3βmRNA的表達水平。Western blot檢測糖原合成信號通路中Akt和GSK3β總蛋白及pAkt(Ser473)和pGSK3β(Ser9)磷酸化蛋白的水平。
　　結(jié)果：高脂飼料喂養(yǎng)12周后的大鼠與正常大鼠相比出現(xiàn)了明顯的BW增加，F(xiàn)PG升高，高

11、胰島素血癥，HOMA-IR升高，高脂血癥等表現(xiàn)，存在IR。藥物處理后實驗對照組的IR大鼠體重增加，利拉魯肽組體重明顯下降；T2DM大鼠利拉魯肽組與實驗對照組體重均下降。IR及T2DM大鼠中，利拉魯肽組FPG、FINS及HOMA-IR指數(shù)明顯低于實驗對照組，HOMA-β與實驗對照組相比上升不明顯。IR大鼠利拉魯肽組TC、LDL-C明顯低于實驗對照組，T2DM大鼠利拉魯肽處理后與實驗對照組相比血脂無明顯變化，但IR和T2DM大鼠經(jīng)利拉魯肽處

12、理后與實驗對照組相比肝臟脂肪變性均有改善。IR和T2DM大鼠肝臟內(nèi)的糖原含量較正常對照組明顯減低，利拉魯肽可有效增加IR及T2DM大鼠肝臟內(nèi)糖原含量。IR及T2DM大鼠與正常對照組相比，肝臟內(nèi)Akt-2 mRNA表達水平、pGSK3β(Ser9)、pAkt(Ser473)及Akt蛋白水平均下調(diào)，GSK3βmRNA表達水平和GSK3β蛋白水平均上調(diào)，但這些變化在IR大鼠中無顯著性差異，而在T2DM大鼠中存在顯著性差異。利拉魯肽可顯著上調(diào)I

13、R及T2DM大鼠肝臟內(nèi)Akt-2 mRNA表達水平、pGSK3β(Ser9)、pAkt(Ser473)及Akt蛋白水平，下調(diào)GSK3βmRNA表達水平和GSK3β蛋白水平。
　　結(jié)論：IR及T2DM大鼠中利拉魯肽可有效控制血糖，降低體重，改善高胰島素血癥及IR，且作用較改善β細胞功能作用出現(xiàn)早。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了T2DM的發(fā)生。利拉魯肽可通過PI3K/Akt/GSK3途徑促進IR及T2DM大鼠肝臟內(nèi)糖原合成，調(diào)節(jié)肝