一種以armored RNA作為報告基團超靈敏的實時免疫RT-PCR方法的建立.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，表達內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性，使其替代酶免檢測中酶的顯色反應(yīng)，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來提高對表面抗原(HBsAg)檢測的靈敏度。 研究方法：采用一種稱為免疫-RT-PCR(IRTPCR)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)報告系統(tǒng)對蛋白抗原進行檢測，首先構(gòu)建原核表達

2、系統(tǒng)，表達內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，擬選用5′-UTR區(qū)作為MS<,2>噬菌體的包裝序列，引物5，端引入HindⅢ酶切位點。與用HindⅢ酶切的表達載體pNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達載體pNCCL1-HCV。在IPTG誘導(dǎo)下，衣殼蛋白會在攜帶有pET-MS<,2>-HCV的細菌中表達，并與reRNA組裝成病毒樣顆粒。在immuno-RT-PCR這個反應(yīng)體系中，包裹特定RNA的重組MS<,2>噬菌體顆粒與傳統(tǒng)ELIS

3、A中和特異抗體相連的報告基團相似，同樣可以形成三明治夾心復(fù)合物，通過加熱使結(jié)合在固相的armored RNA裂解，釋放出特異的RNA，可以通過RT-PCR 進行檢測。 研究結(jié)果：本研究得到的表達載體pET-MS<,2>-HCV及原核表達系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNase的HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的平臺。通過RT-PCR可以提高免疫檢測的靈敏度。采用HBsAg作為三明治夾心中的待測抗原進行實時免疫RT-PCR，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免

4、疫吸附實驗相比，檢測的靈敏度提高了10000至100000倍?？梢杂貌煌腶rmored RNA采用多重實時RT-PCR 的方法同時檢測多種不同的靶抗原。這種方法可以作為一種新的超靈敏的免疫檢測方法應(yīng)用于臨床診斷以及科研。 研究結(jié)論：成功構(gòu)建得到了質(zhì)粒驅(qū)動的包裝系統(tǒng)，經(jīng)原核表達得到了內(nèi)含HCV reRNA的病毒樣顆粒。成功的進行了病毒樣顆粒與單克隆抗體的交聯(lián)，得到了能夠用于檢測的mAb-armored．RNA的結(jié)合物，從而使對H