卟啉光動(dòng)力納米藥物制備及腫瘤抑制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　化療是惡性腫瘤治療的主要手段之一。但傳統(tǒng)化療藥物缺乏腫瘤選擇性，毒副作用大，并且長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥，是造成化療失敗的重要原因。目前，肝癌患者尚沒(méi)有化療方案顯示出生存獲益，因?yàn)楦伟┗颊咂毡閷?duì)化療具有耐藥性，對(duì)化療不敏感。
　　光動(dòng)力療法是近年來(lái)一種新興的腫瘤治療方案。光敏藥物進(jìn)入體內(nèi)，富集于病灶后，在匹配吸收波長(zhǎng)的激光作用下，能生成活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。但由于光敏劑水溶性較差，臨床上很

2、難直接注射;此外，光敏劑穩(wěn)定性較差，很難在腫瘤部位長(zhǎng)久富集，因此光動(dòng)力治療目前在臨床只是做為輔助治療方案。
　　雖然這些治療手段在目前的腫瘤治療上發(fā)揮了重要的作用，但仍存在自身的弊端和無(wú)法完全抑制腫瘤的缺點(diǎn)，因此發(fā)展兩種或多種腫瘤治療手段協(xié)同作用的聯(lián)合治療方法，成為腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。多功能納米載體能夠?qū)崿F(xiàn)多種功能如長(zhǎng)循環(huán)、靶向以及不同作用機(jī)制治療方法的有效整合，滿足臨床對(duì)腫瘤聯(lián)合治療的需求。
　　目前，已有大量關(guān)于多功

3、能納米藥物對(duì)腫瘤聯(lián)合治療的報(bào)導(dǎo)，但由于其生物相容性及生物可降解性等方面的局限，極大的限制了在臨床上的應(yīng)用。本文擬設(shè)計(jì)并構(gòu)建以生物體自有分子——血卟啉為基礎(chǔ)的可直接用于臨床注射的腫瘤靶向納米藥物，聯(lián)合光動(dòng)力學(xué)治療與化療，考察其逆轉(zhuǎn)耐藥乳腺癌細(xì)胞ADR/MCF-7化療耐藥的作用和相關(guān)分子機(jī)制，及在耐藥乳腺癌、肝癌裸鼠荷瘤模型中的腫瘤靶向和體內(nèi)抑瘤效果。
　　研究方法:
　　1)運(yùn)用聚乙二醇修飾血卟啉合成光動(dòng)力納米材料HPP，負(fù)載

4、抗腫瘤藥物阿霉素制成光動(dòng)力納米藥物HPPD。利用核磁共振分析納米微粒的結(jié)構(gòu)，透射電子顯微鏡及動(dòng)態(tài)光散射研究其形貌及粒徑。高效液相色譜分析檢測(cè)藥物的體外釋放行為。
　　2)運(yùn)用MTT法檢測(cè)游離藥物組Dox，納米藥物組HPPD及聯(lián)合光動(dòng)力療法處理組HPPD，ADR/MCF-7細(xì)胞中藥物半數(shù)抑制濃度和細(xì)胞增殖能力的變化。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)不同處理組細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。激光共聚焦觀察藥物在耐藥乳腺癌及親本細(xì)胞中的藥物分布和亞細(xì)胞定位。

5、>　　3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞色素c的亞細(xì)胞定位，Western blot檢測(cè)線粒體凋亡通路關(guān)鍵成員的蛋白表達(dá)變化。
　　4)建立耐藥乳腺癌、肝癌裸鼠皮下模型及狨猴肝癌原位模型，Cy5.5熒光標(biāo)記納米藥物HPPD，活體動(dòng)物成像考察其腫瘤靶向性。
　　5)尾靜脈注射游離藥物Dox或納米藥物HPPD，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，考察體內(nèi)抑瘤效果。HE染色檢測(cè)HPPD的生物安全性;HPLC檢測(cè)藥物在各組織臟器的分布;血

6、清生化檢測(cè)分析不同處理組阿霉素的心臟毒性。
　　結(jié)果:
　　1)核磁譜圖結(jié)合透射電子顯微鏡結(jié)果表明，聚乙二醇通過(guò)酰胺鍵與血卟啉偶聯(lián)形成具有核殼結(jié)構(gòu)的光動(dòng)力納米膠束HPP，外形為球形或接近球形，粒徑為24.38±1.02 nm。HPP能夠高效負(fù)載阿霉素，載藥納米微粒HPPD的粒徑為35.60±2.05 nm，體外釋放結(jié)果表明藥物具有顯著的pH敏感釋放特性，并且結(jié)合光照后，藥物在弱酸性環(huán)境中的釋放速率進(jìn)一步加快。
　　2)

7、和游離阿霉素相比，HPPD結(jié)合光照治療組對(duì)阿霉素耐藥的人乳腺癌細(xì)胞（ADR/MCF-7）生長(zhǎng)的抑制作用顯著增加，有效逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的耐藥性，逆轉(zhuǎn)指數(shù)高達(dá)12。
　　3)激光共聚焦觀察表明，游離阿霉素主要分布于ADR/MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞漿;HPPD可實(shí)現(xiàn)阿霉素由胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位，結(jié)合光照治療后，藥物在胞核中的分布進(jìn)一步增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證明，聯(lián)合治療法有效增加了耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取。
　　4)流式細(xì)胞術(shù)分析表明HPPD

8、結(jié)合光照治療顯著誘導(dǎo)了耐藥細(xì)胞的凋亡。激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)中，Western blot結(jié)果表明細(xì)胞漿中細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子表達(dá)明顯升高。
　　5)皮下接種ADR/MCF-7細(xì)胞，構(gòu)建異位移植瘤裸鼠模型，尾靜脈給藥，結(jié)果顯示游離的阿霉素或HPP結(jié)合光照后不能顯著抑制腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng);而HPPD治療裸鼠三周后，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的完全消除，結(jié)合光照后，兩周即可完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，HPPD對(duì)于肝癌皮下模型也具有很

9、好的腫瘤抑制效果。
　　6) HPPD具有較好的體內(nèi)腫瘤靶向性。ADR/MCF-7皮下成瘤裸鼠尾靜脈注射給藥后2h后，HPPD主要富集于腫瘤組織和腎臟;24h后，只在腫瘤部位觀測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明HPPD有很好的腫瘤滯留性。此外MHCC-97H肝癌皮下成瘤裸鼠以及DENA藥物誘導(dǎo)的肝癌原位模型狨猴體內(nèi)也觀察到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　7)尾靜脈注射游離阿霉素和HPPD24 h后，用HPLC考察藥物在裸鼠體內(nèi)分布。相對(duì)于游離藥

10、物組，HPPD在腫瘤內(nèi)的藥物分布提高至2-3倍，心臟分布降低了約55％。
　　HPPD能顯著降低阿霉素的毒性。在耐藥乳腺癌和肝癌皮下荷瘤模型中，相對(duì)于游離藥物組，心肌磷酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)表達(dá)明顯降低;H&E結(jié)果表明，HPPD處理組對(duì)裸鼠的組織臟器沒(méi)有毒性;血清生化試驗(yàn)表明，HPPD可有效減少阿霉素的心臟毒性。
　　結(jié)論:
　　本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生物安全的基于生物體自有材料——血卟啉的納米藥