非T細胞結(jié)合肽對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及免疫學機制探討.pdf

1、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進展性、自身免疫性疾病，以炎性細胞在關(guān)節(jié)滑膜處浸潤，滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及骨的持續(xù)破壞為特征。由于RA病因未明，缺乏根本治療藥物，故成為世界性治療難題。因此探索RA的病理生理過程，研究治療RA的藥物越來越受到重視。非T細胞結(jié)合肽(NTAP)是處于研發(fā)階段的用于抗原介導、基因相關(guān)的全身性免疫疾病——類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。經(jīng)過數(shù)十年的研究，通過對系列先導化合

2、物的篩選而獲得。膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型是具備細胞免疫和體液免疫兩種變化的慢性、系統(tǒng)性炎癥動物模型，以多發(fā)性的末端關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病機制及臨床特征與RA最為相似，模型也較為穩(wěn)定，是目前國際上公認的成熟的模型，被廣泛應(yīng)用于RA發(fā)病機制以及篩選治療RA藥物的研究。因此本研究擬建立膠原誘導性關(guān)節(jié)炎動物模型，觀察非T細胞結(jié)合肽對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療作用以及對大鼠血清中炎癥細

3、胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ及Ⅱ型膠原(CⅡ)抗體水平的調(diào)控作用，并檢測其對大鼠外周血T細胞分型的影響，探討非T細胞結(jié)合肽治療RA的免疫學機制，為非T細胞結(jié)合肽臨床用于治療RA提供實驗依據(jù)。
　　第一部分非T細胞結(jié)合肽對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療作用
　　目的:觀察非T細胞結(jié)合肽對類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大鼠，隨機分為空白對照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內(nèi)注

4、射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強免疫1次。成模大鼠隨機分為模型組、非T細胞結(jié)合肽低劑量組(0.25mg/kg)、非T細胞結(jié)合肽中劑量組(0.5mg/kg)、非T細胞結(jié)合肽高劑量組(1.0mg/kg)和甲氨蝶呤組(0.5 mg/kg)，每組動物至少8只。非T細胞結(jié)合肽低、中、高劑量組尾靜脈注射給藥，隔日給藥一次。模型組和空白對照組以相同方法和體積注射PBS。甲氨蝶呤組腹腔注射，每周兩次，各組大鼠按0.5 mL/100

5、 g的體積給予相應(yīng)藥物，治療三周。造模后隔日對各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥進行評分。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ及Ⅱ型膠原抗體的水平。對踝關(guān)節(jié)進行組織病理學檢查，觀察關(guān)節(jié)的病理變化。
　　結(jié)果:
　　1、炎癥評分的變化
　　隨著造模時間的延長，除空白對照組，各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，關(guān)節(jié)炎評分逐漸增高。與空白對照組比較，模型組大鼠的炎癥評分明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較，非T細

6、胞結(jié)合肽低劑量組的炎癥評分有所降低，但無統(tǒng)計學差異;非T細胞結(jié)合肽中、高劑量組的炎癥評分明顯降低(P＜0.01);甲氨蝶呤組的炎癥評分明顯降低(P＜0.01)。
　　2、血清細胞因子及Ⅱ型膠原抗體水平變化
　　與空白對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ、CⅡ抗體水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，非T細胞結(jié)合肽高劑量組血清中的TNF-α、IL-6、IFN-γ、CⅡ抗體水平明顯降低(P＜0.01或

7、P＜0.05);甲氨蝶呤組大鼠血清中的TNF-α、IL-6明顯降低(P＜0.05);非T細胞結(jié)合肽中劑量組大鼠血清中的IFN-γ明顯降低(P＜0.05)。
　　3、組織病理學變化
　　空白對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，無炎性細胞浸潤，未見明顯病變。模型組大鼠滑膜細胞增生，滑膜組織中有大量炎細胞浸潤，滑膜襯里層增厚，骨與關(guān)節(jié)軟骨組織有明顯損傷。給藥組大鼠病理損傷較模型組明顯輕。
　　結(jié)論:采用牛Ⅱ型膠原免疫大

8、鼠成功的復制了類似人類RA的病理模型，觀察非T細胞結(jié)合肽對關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。結(jié)果表明非T細胞結(jié)合肽可以明顯減輕CIA大鼠發(fā)病關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)程度、抑制后期骨損傷和骨破壞，非T細胞結(jié)合肽對CIA大鼠有很好的治療效果，并且呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系。
　　第二部分非T細胞結(jié)合肽對T細胞亞群分化的影響
　　目的:觀察非T細胞結(jié)合肽對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中T細胞亞群分化的影響。
　　方法:選擇6-7周齡的Lewis雌性大

9、鼠，隨機分為空白對照組和CIA模型組。CIA模型組大鼠于尾根部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑配制的乳劑，7天后同法加強免疫1次。成模大鼠隨機分為模型組、非T細胞結(jié)合肽組，每組動物至少8只。給藥方式分為:單次給藥和多次給藥，給藥劑量為1mg/kg，尾靜脈注射給藥。單次給藥后，各組大鼠分別于給藥2h、48 h、96 h和144 h眼眶內(nèi)眥靜脈取血，采用流式細胞術(shù)測定外周血中Th1、Th2、Th17、Treg細胞的比例。然后在上述大鼠炎癥

10、評分最高時進行多次給藥，給藥方法同單次給藥，時間為隔天一次，連續(xù)兩周，給藥結(jié)束后144 h，處死大鼠，腹主動脈取血，測定外周血Th1、Th2、Th17和Treg細胞水平。模型組和空白對照組以相同方法和體積注射PBS。給藥期間對各組大鼠進行炎癥評分。
　　結(jié)果:
　　1、炎癥評分的變化
　　與空白對照組比較，模型組大鼠的炎癥評分均明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，非T細胞結(jié)合肽單次給藥組大鼠炎癥評分有所下降，但是無

11、統(tǒng)計學差異;非T細胞結(jié)合肽多次給藥大鼠炎癥評分明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　2、外周血T細胞亞群分化的變化
　　與空白對照組比較，模型組Th1、Th17細胞比例升高，Th2、Treg細胞比例明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，非T細胞結(jié)合肽組Th1、Th17細胞比例明顯降低，Th2、Treg細胞比例明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　非T細胞結(jié)合肽可減輕及延緩