Semaphorin4D對(duì)非小細(xì)胞肺癌血管生成擬態(tài)形成及遷移侵襲能力的影響.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討:
　　第一部分：Semaphorin4D和血管生成擬態(tài)在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：探討Semaphorin4D和血管生成擬態(tài)在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法：運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)60例非小細(xì)胞肺癌和10例肺良性病變組織中Semaphorin4D（Sema4D）蛋白的表達(dá)，并采用PAS糖原染色及免疫組化雙重染色法檢測(cè)血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimic

2、ry,VM）的表達(dá),分析Sema4D和VM與各臨床因素間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：Sema4D在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和肺良性疾病組織中的表達(dá)：Sema4D蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，60例NSCLC組織中Sema4D表達(dá)陽(yáng)性率為65％，10例肺良性疾病中表達(dá)陽(yáng)性率為30％，Sema4D在NSCLC中的表達(dá)高于肺良性疾病組織（P＜0.05）。在肺良性病變組織中未發(fā)現(xiàn)VM，23.3％的非小細(xì)胞肺癌組織中發(fā)現(xiàn)VM陽(yáng)性表達(dá)。存在VM的NS

3、CLC組織中Sema4D的表達(dá)高于無(wú)VM組，Sema4D陽(yáng)性組中VM的表達(dá)高于Sema4D陰性組，兩者具有相關(guān)性（r=0.322，P＜0.05）。Sema4D在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系：Sema4D陽(yáng)性組的NSCLC比Sema4D陰性組分化差（P＜0.05）；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期Sema4D陽(yáng)性率48.4％，Ⅲ-Ⅳ期Sema4D陽(yáng)性率82.8％，Ⅲ-Ⅳ期患者組織中有更多Sema4D的表達(dá)（P＜0.05），且Sema4D陽(yáng)

4、性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高（P＜0.05）。VM與臨床因素的關(guān)系：低分化的NSCLC中42.3％存在VM，而中-高分化組VM陽(yáng)性率為8.8％（P＜0.05）；VM在Ⅰ-Ⅱ期NSCLC中陽(yáng)性表達(dá)率（9.7％）低于Ⅲ-Ⅳ期（37.9％），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；淋巴結(jié)受累的NSCLC中VM表達(dá)更多（P＜0.05）。
　　結(jié)論：VM和Sema4D在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)均高于肺良性病變組織，兩者具有相關(guān)性，且表達(dá)VM和/或Sema4D

5、的NSCLC分化差、TNM分期較晚、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，VM和Sema4D或可作為判斷NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　第二部分：慢病毒介導(dǎo)的siRNA靶向沉默肺癌細(xì)胞株Semaphorin4D
　　目的：構(gòu)建靶向Semaphorin4D（Sema4D）的RNA干擾慢病毒載體，并感染肺癌H358、A549、H460及H1975細(xì)胞株，檢測(cè)感染慢病毒載體前后Sema4D mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

6、>　　方法：設(shè)計(jì)靶向沉默Sema4D的siRNA序列，構(gòu)建慢病毒載體并通過(guò)基因檢測(cè)鑒定。慢病毒載體感染4種不同病理類型肺癌細(xì)胞株（A549、H358、H460及H1975）。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和Western blot法分別檢測(cè)感染前后4種細(xì)胞中Sema4D在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：靶向Sema4D的RNA干擾慢病毒載體成功感染肺癌A549、H358、H460及H1975細(xì)胞株。感染后4株肺

7、癌細(xì)胞中Sema4D在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)與未處理組（CON組）及感染對(duì)照病毒組（NC組）相比明顯降低（P＜0.05），CON組與NC組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：所構(gòu)建的靶向Sema4D的RNA干擾慢病毒載體能夠有效地沉默肺癌A549、H358、H460及H1975細(xì)胞株中Sema4D的表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分：RNA干擾靶向沉默Semaphorin4D對(duì)肺癌細(xì)胞株血管生成擬態(tài)形成及遷

8、移侵襲能力的影響
　　目的：探討慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾靶向沉默Semaphorin4D（Sema4D）對(duì)肺癌細(xì)胞株A549、H358、H460和H1975血管生成擬態(tài)形成及侵襲遷移能力的影響。
　　方法：構(gòu)建肺癌A549、H358、H460和H1975細(xì)胞株血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry， VM）的體外三維培養(yǎng)模型，運(yùn)用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)已成功感染靶向Sema4D的RNA干擾慢病毒載體的肺癌A549、H

9、358、H460及H1975細(xì)胞株形成VM管道的能力變化，運(yùn)用Transwell小室法檢測(cè)它們遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建肺癌A549、H358、H460和H1975細(xì)胞株血管生成擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其中H1975細(xì)胞所形成的VM管道周長(zhǎng)及面積均最大。4株肺癌細(xì)胞均分為RNAi組（感染靶向Sema4D的RNA干擾慢病毒載體組）、NC組（感染對(duì)照慢病毒載體組）及CON組（未做處理組），4株肺癌細(xì)胞中RNAi組的VM

10、管道周長(zhǎng)及面積均小于NC組及CON組（P＜0.05），而NC組與CON組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其中肺癌H358細(xì)胞RNAi組未見(jiàn)VM形成。體外遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中，4株肺癌細(xì)胞中RNAi組穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯少于NC組和CON組（P＜0.05），而NC組與CON組穿膜細(xì)胞數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：靶向Sema4D的RNA干擾慢病毒載體可以有效抑制肺癌A549、H358、H460和H1975細(xì)胞株血管生成