非小細(xì)胞肺癌中相關(guān)microRNA的篩選及miR-191對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力影響的研究.pdf

1、目的:現(xiàn)有研究表明miRNA在多種惡性腫瘤中存在不一樣水平的表達(dá)異常。本研究旨在探究非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中相關(guān)的miRNA，如miR-195、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-126等是否存在表達(dá)異常，并選擇在NSCLC中存在表達(dá)異常的miRNA，分析其與患者臨床病理特性的關(guān)系及對(duì)患者總生存期的影響;通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探究相關(guān)miRNA(miR-191

2、)對(duì)A549人肺腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲等細(xì)胞功能的影響。
　　方法:第一部分查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定miR-195、miR-145、miR-140-3p、miR-191、miR-126等可能與NSCLC相關(guān)的microRNA作為研究對(duì)象。采用實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative realtime polymerase chainreaction，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織及癌旁組織中miRNA的表

3、達(dá)的差異性，初步分析各miRNA的表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性，根據(jù)分析結(jié)果初步篩選出可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，根據(jù)篩選結(jié)果擴(kuò)大樣本驗(yàn)證初步篩選的結(jié)論，并收集標(biāo)本對(duì)應(yīng)患者的臨床病理特征資料及電話隨訪其生存情況，進(jìn)一步分析所選miRNA與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。
　　第二部分憑據(jù)第一步篩選結(jié)果，我們確定miR-191為我們進(jìn)一步研究的對(duì)象，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將miRNA-NC、miR-191 inhibitor轉(zhuǎn)入

4、A549細(xì)胞中，并根據(jù)結(jié)果分為三組，空白組(Mock)、陰性對(duì)照組(NC)、實(shí)驗(yàn)組(miR-191 inhibitor)，并對(duì)各組A549細(xì)胞進(jìn)行一下研究:①劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞24h后的遷移能力的改變;②Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:第一部分初步篩選中我們對(duì)34例NSCLC患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)miR-195、miR-145、miR-140-3p等miRNA在

5、腫瘤組織中的表達(dá)量與癌旁組織的表達(dá)量無(wú)明顯改變(p＞0.05);而相對(duì)于腫瘤組織，miR-191、miR-126兩者表達(dá)量存在差異(p＜0.05)。增加檢測(cè)樣本后，我們發(fā)現(xiàn)其差別趨勢(shì)仍存在，相對(duì)于癌旁組織中的表達(dá)量，miR-191在腫瘤組織的表達(dá)上調(diào)(p＜0.05); miR-126在腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)（p＜0.05）。收集患者臨床病理特征資料，電話隨訪患者生存狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn):在腫瘤組織分化程度較低的和（或）存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的

6、患者中miR-191的表達(dá)量升高更明顯(p＜0.05)，另外miR-191的表達(dá)量較高的患者較miR-191的表達(dá)量較低的患者的總生存期更短(p＜0.05);而在miR-126的臨床病理特征分析及患者總生存期的研究中并未發(fā)現(xiàn)這種不同(p＞0.05)。
　　第二部分通過(guò)組織RT-qPCR檢測(cè)及相關(guān)數(shù)據(jù)分析后，我們選擇miR-191作為我們的研究對(duì)象，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法順利將miRNA-NC、miR-191 inhibitor轉(zhuǎn)入A5

7、49細(xì)胞中，并根據(jù)結(jié)果分為三組，空白組(Mock組)、陰性對(duì)照組(NC組)、實(shí)驗(yàn)組（miR-191 inhibitor組），分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)相對(duì)于Mock組、NC組，實(shí)驗(yàn)組的miR-191的表達(dá)量下調(diào)約98％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p＜0.05），而Mock組和NC組中miR-191的表達(dá)量無(wú)明顯的差異(p＞0.05)。成功沉默miR-191后，我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默后的A549細(xì)胞遷移能力的改變，與空白對(duì)照(Mock)及陰性對(duì)照(m

8、iR-NC)相比，沉默miR-191后A549細(xì)胞的劃痕愈合的距離顯著減小，劃痕愈合的時(shí)間顯著變長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲能力改變，發(fā)現(xiàn)相比與Mock組(124.00+6.56)、miR-NC組(123.00+9.95)，miR-191 inhibitor組(38.33+5.69)穿過(guò)半透膜的細(xì)胞數(shù)日明顯減少，細(xì)胞侵襲能力被削弱，差異含有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　

9、　結(jié)論:1、miRNA在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要的角色，其中miR-191在非小細(xì)胞肺癌患者中表達(dá)上調(diào)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者生存期有關(guān)，miR-191在組織分化程度較低者，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)量更高，且miR-191高表達(dá)者總生存期更短。而miR-126在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)成下調(diào)趨勢(shì)，并且它的表達(dá)量與患者的臨床病理特征及患者的總生存期無(wú)明顯的關(guān)系(p＞0.05)。
　　2、根據(jù)組織實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們選擇miR