樺褐孔菌菌株親緣關(guān)系及人工馴化栽培研究.pdf

1、樺褐孔菌Inonotus obliquus(Fr．)Pilát是十分珍稀而又名貴的藥用真菌，以菌核入藥。在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidimycotina)、層菌綱(Hymenomycotes)、非褶菌目(Aphylloptlorales)、刺革菌科(Hymenochaelaceae)。樺褐孔菌的菌絲體極其耐寒，主要分布在北半球北緯45°～50°的地區(qū)。國外對(duì)樺褐孔菌的藥理作用及其化學(xué)成分的研究比較深入，而國內(nèi)的研究則剛剛起步，且

2、局限于形態(tài)學(xué)研究。樺褐孔菌的分子學(xué)、人工栽培研究幾乎空白。目前樺褐孔菌的野生資源曰益枯竭，人工馴化栽培迫在眉睫。為此，我們于2004-2006年利用從不同地域采集的樺褐孔菌野生菌核分離得到的純菌絲為試材，通過拮抗試驗(yàn)、同工酶、RAPD分子標(biāo)記對(duì)樺褐孔菌菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，并對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行了人工馴化栽培研究。主要研究結(jié)果如下： 1、對(duì)樺褐孔菌菌株菌絲間的拮抗性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明：樺褐孔菌各菌株間差異屬于地理分布差異，其

3、中，菌株CX01與CX02親緣關(guān)系最近，其次是JL03與JL01，JL02。 2、采用不同的提取劑，在同一條件下對(duì)樺褐孔菌菌絲體過氧化物酶同工酶進(jìn)行提取，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)樺褐孔菌菌絲體的過氧化物酶同工酶譜帶進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明：采用Tris-HC1(pH6.9)，做為提取劑制備的樣品液經(jīng)電泳后，在圖譜中條帶豐富,帶型清晰，提取效果最好；Tris-甘氨酸(pH8.3)提取效果最差。 3、采用聚丙烯酰胺凝膠

4、電泳技術(shù)，對(duì)采自6個(gè)不同地區(qū)的樺褐孔菌菌核分離得到的菌株純菌絲過氧化物酶同工酶進(jìn)行研究。結(jié)果表明：所有菌株酶帶數(shù)目在2～8條之間，在Rf=0.75、Rf=0.98處為樺褐孔菌菌株的特征酶帶。Fuzzy聚類法數(shù)量分析表明，菌株間隸屬度在[0.250，1.000]之間，當(dāng)隸屬度為0.250時(shí)分析菌株的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，朝鮮的菌株與吉林的菌株親緣關(guān)系較近與黑龍江的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌株間的遺傳差異屬于地理分布(緯度)差異，部分菌株間存在較近

5、的親緣關(guān)系。 4、用CTAB改良法對(duì)樺褐孔菌菌絲體基因組DNA進(jìn)行了提取，并以其為模板對(duì)影響RAPD擴(kuò)增的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增體系最佳反應(yīng)條件是：在25μl體積中，模板DNA濃度為40 ng/μl，10堿基引物濃度為10pmol，Mg<'2+>濃度為2namol/L，TaqDNA聚合酶1unit，dNTPs濃度為100μmol/L，加ddH<,2>O至25μl反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94

6、℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1,5min，45個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5min。 5、采用RAPD技術(shù)對(duì)來自不同地區(qū)的樺褐孔菌菌株親緣關(guān)系進(jìn)行研究，獲得了樺褐孔菌不同菌株的DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示：12個(gè)引物共擴(kuò)增出167條帶，其中101條為多態(tài)性帶，多態(tài)性比率為60.5％，同一培養(yǎng)時(shí)期的各菌株間RAPD圖譜存在一定的地理分布差異，部分菌株間存在較近的親緣關(guān)系。若以遺傳距離0.508為結(jié)合線，可將供試菌株劃分為三大

7、類，朝鮮的菌株CX01、CX02(緯度為39.01°-40.80°)歸為一類，吉林省的菌株JL01、JL02、JL03、JL04、JL05(緯度為42.93°-43.35°)歸為一類，黑龍江的菌株HLJ01(緯度為47.20°-50.13°)單獨(dú)聚為一類。朝鮮的菌株與吉林的菌株親緣關(guān)系較近與黑龍江的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌株分類結(jié)果與各菌株的地理分布(緯度)差異一致，可以確定各菌株間屬于種內(nèi)及地理分布差異，部分菌株間存在較近的親緣關(guān)系。

8、 6、以樺褐孔菌野生菌核采用組織分離法獲得純菌種，并進(jìn)行了樺褐孔菌各級(jí)菌種的制作及人工馴化栽培研究。結(jié)果表明：樺褐孔菌母種培養(yǎng)基以葡萄糖2.0g、黃豆粉10g、KH<,2>PO<,4>1g、MgSO<,4>0.5 g、水1000ml，pH自然為最佳；原種培養(yǎng)基以玉米粒為最好；菌核人工栽培培養(yǎng)料以樺木屑52％、玉米芯26％、麥麩20％、白糖l％、石膏1％、水分65％為最好，生物學(xué)效率達(dá)30.8％：樺褐孔菌菌核發(fā)生適宜溫度范圍在22～2