重組hIFN-α-2b-BCG菌苗對膀胱腫瘤免疫治療的實驗研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來的小劑量BCG和干擾素-α聯(lián)合灌注的方案在治療膀胱淺表腫瘤、預防腫瘤復發(fā)方面顯示出了較好的耐受性和較高的完全反應率<'[1][2][3]>，在鼠的膀胱癌模型試驗中也顯示，BCG和干擾素-α聯(lián)合應用的療效均優(yōu)于二者單獨應用<'[4][5]>。BCG與干擾素-α聯(lián)合應用時，由于降低了BCG用量，從而減輕了其毒副作用又保持了其抗腫瘤活性，同時，降低了干擾素-α大劑量反復灌注產(chǎn)生的高昂費用。雖然到目前

2、為止干擾素-α提高 BCG 抗腫瘤作用的確切機制尚未清楚，但最近研究結(jié)果顯示，干擾素-α可在以下幾方面提高 BCG 的免疫活性：①協(xié)同免疫細胞誘導IFN-<,γ>、IL-2<'[19]>、IL-6、IL-8、GM-CSF 和 TNF-α等細胞因子產(chǎn)生<'[6][7]>；②活化T細胞增殖；③提高對膀胱腫瘤的直接作用，如直接抑制生長等。 為了解決聯(lián)合灌注中干擾素半衰期短、用量大的缺點，自身能分泌細胞因子的重組BCG成為了新的研究熱點

3、。隨著基因重組與分子克隆技術(shù)發(fā)展與進步，一種能夠在 Escherichia-coli 和 BCG 共同復制外源基因的載體，以及載體上HSP(heat-shock protein，熱休克蛋白)啟動子和SS(信號序列)的發(fā)現(xiàn)，開始使重組BCG能夠有效的表達不同的細胞因子、標志蛋白和抗原，重組BCG進入了一個新的時代。重組BCG以野生型BCG作為工程菌，利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胍吧虰CG中，依靠BCG在宿主內(nèi)復制，表達多種外源抗原，以

4、誘導對多種疾病的特異性體液和細胞免疫。這種基因工程BCG疫苗與分枝桿菌佐劑加病原體抗原配制的混合疫苗相比，重組BCG集佐劑和載體于一身，兼多種外源基因與活疫苗于一體，一次接種可獲得強而持久的多種特異性免疫。 重組BCG的成功構(gòu)建也引發(fā)了新的課題，就是其體外生物學行為、細胞因子表達的穩(wěn)定性、菌苗體外的抗腫瘤細胞增殖作用及活化誘導效應細胞的抗腫瘤活性、體內(nèi)對腫瘤的治療作用及全身和局部的免疫效應等等問題，本課題的目的就是分別采用體內(nèi)外

5、實驗，探討重組 hIFN-a-2b-BCG 菌苗的抗腫瘤效果及其作用機制，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1、重組hIFN-a-2b-BCG 對外周血淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié) (1)測定重組BCG上清液中hIFN-a-2b的含量，與外源性hIFN-a-2b比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組BCG上清液IFN-a-2b濃度相當于5000IU/ml。 (2)分離人外周血中的單個核細胞(Peripheral blood monocytes，PBM

6、C)，將其和0.01OD 終濃度的重組BCG、野生型BCG以及野生型BCG聯(lián)合干擾素-a共同培養(yǎng)，用MTT法測定PBMC增殖，并用ELISA法檢測培養(yǎng)液中TH1型細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-a分泌水平。比較重組BCG與野生型BCG對PBMC誘導活化的不同效果；與野生型BCG聯(lián)合干擾素組對比，比較一次性外源性干擾素的加入和重組BCG持續(xù)表達IFN-a-2b的作用效果。結(jié)果表明，重組BCG自身持續(xù)分泌IFN-a-2b對PBMC活

7、化效果明顯，PBMC增殖在72小時達峰值，增殖比例為4.96倍，高于野生BCG的2.5倍和野生型BCG聯(lián)合干擾素組的3.6倍。tH1型細胞因子測定結(jié)果也得到同樣的結(jié)論，測定PBMC活化表達IFN-γ的量峰值達到2977pg/ml、IL-12為292pg/ml、TNF-a 為 7914pg/ml，高于野生型BCG測定結(jié)果，且重組BCG活化PBMC效果強而持久，明顯優(yōu)于一次性干擾素的加人效果。 (3)對重組BCG上清液IFN-a-2

8、b與等量外源性干擾素誘導tH1型細胞因子的生成水平進行比較，實驗結(jié)果顯示，上清液IFN-a-2b與等量的外源性干擾素生物學活性相近。 2、重組hIFN-a-2b-BCG 抗膀胱腫瘤細胞效應的體外研究 (1)不同濃度重組BCG活化PBMC生成rBAK(Recombinant bacillusCalmette-Guerin activated killer)細胞，與人膀胱腫瘤細胞EJ共同培養(yǎng)，采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢

9、測rBAK 細胞對腫瘤細胞的殺傷效果，結(jié)果顯示，未經(jīng)誘導的淋巴細胞殺傷活性明顯低下(7.6％)，不同濃度的野生型BCG活化的BAK(bacillus Calmette-Guerin activated killer)細胞殺傷活性為12.38～20.89％；野生BCG 與干擾素聯(lián)合組活化效應細胞殺傷活性為15.78～34.72％；重組BCG活化的rBAK細胞殺傷效果達到實驗組最高，為20.31-51.22％，與野生型BCG組相比有統(tǒng)計學差

10、異。 (2)重組BCG與膀胱腫瘤細胞(EJ、MB49)共同培養(yǎng)，光鏡下可見腫瘤細胞變圓，增殖速度明顯減緩，部分細胞脫壁，胞漿可見大量空泡和顆粒狀物質(zhì)，細胞周圍有菌群包繞，；透射電鏡下可見腫瘤細胞表面微絨毛脫落，染色質(zhì)溶解，細胞質(zhì)壞死，出現(xiàn)大量空泡，細胞表面有出泡現(xiàn)象；吖啶橙染色可見腫瘤細胞聚集成團狀細胞球體，胞突消失，細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體出現(xiàn)；Hoechst33258 染色后熒光顯微鏡下可見大量腫瘤細胞出現(xiàn)明亮的藍色熒光，

11、表明重組BCG成功誘導腫瘤細胞凋亡。 (3)重組BCG與EJ細胞共同培養(yǎng)后48小時DNA電泳出現(xiàn) DNA Ladder，表明EJ 細胞出現(xiàn)凋亡。 (4)MTT法測定重組BCG對膀胱腫瘤細胞(EJ、MB49)的抑制效應，結(jié)果表明腫瘤細胞的生長隨著共同培養(yǎng)時間的延長不同程度的被重組BCG所抑制，且抑制率高于野生型BCG。 (5)重組BCG誘導MB49細胞凋亡的流式測定，24小時檢測，野生型BCG誘導凋亡率為10.81

12、％，而重組BCG誘導凋亡率達19.71％；48小時檢測，野生型BCG為20.94％，重組BCG為46.58％，二者比較有顯著性差異(P<0.05)。 (6)流式細胞檢測表明，重組BCG與小鼠膀胱腫瘤細胞共同培養(yǎng)后，上調(diào)MB49細胞MHC-I 抗原的表達，具有時間依賴性，且上調(diào)比例明顯高于野生型BCG，表明重組BCG有效提高腫瘤細胞的免疫原性，誘導免疫攻擊。 3、重組hIFN-a-2b-BCG 對原位膀胱腫瘤小鼠模型治療效

13、應的研究 (1)成功構(gòu)建了C57BL/6 原位膀胱腫瘤小鼠模型，重組BCG灌注治療組的小鼠平均膀胱重量顯著低于PBS對照組，與野生型BCG治療組、野生BCG+IFN治療組相比雖無統(tǒng)計學差異，但重組BCG治療組的小鼠生存率高于野生型BCG治療組，提示重組BCG對膀胱腫瘤的預后有一定的關(guān)系。 (2)采用流式細胞儀對小鼠膀胱灌注治療后的淋巴細胞亞群進行分析，并測定小鼠血清中mTNF-a和 mIL-12 的水平，了解小鼠全身免疫

14、狀況。結(jié)果顯示重組BCG 灌注治療后小鼠外周血CD4<'+>T 細胞的比例明顯增高，而CD8<'+>T細胞的比例則無明顯變化，CD4<'+>/CD8<'+>比例大幅提高，糾正了荷瘤小鼠治療前普遍存在的比例失調(diào)；荷瘤小鼠的外周血中TH1型細胞因子mTNF-a和mIL-12水平灌注治療后大幅提高，表明重組BCG灌注具有增強荷瘤小鼠細胞免疫的作用。 (3)腫瘤組織冰凍切片進行T細胞亞群的免疫組織化學分析，了解重組BCG灌注治療后膀胱局

15、部免疫反應。重組BCG組的瘤組織內(nèi)CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>檢測強陽性，說明有大量淋巴細胞浸潤，局部免疫反應明顯。 (4)免疫組化檢測P53和Fas在小鼠膀胱腫瘤中的表達。荷瘤小鼠膀胱腫瘤表達Fas為弱陽性，而重組BCG灌注后Fas呈明顯的陽性表達，表明重組BCG可以顯著提高Fas在膀胱腫瘤細胞的表達，增強了腫瘤細胞的免疫原性；荷瘤小鼠膀胱腫瘤P53表達強陽性，腫瘤浸潤迅速，惡性度高，重組BCG灌注治療后，P

16、53表達顯著下降，提示重組BCG與防止腫瘤惡性度增高有一定的關(guān)系。 通過以上研究，本文認為，重組 hIFN-a-2b-BCG 具有調(diào)節(jié)人外周血淋巴細胞增殖、活化 TH1 型細胞因子表達的能力，誘導殺傷膀胱腫瘤細胞；自身可抑制腫瘤細胞生長，誘導凋亡，上調(diào)腫瘤細胞 MHC-I 抗原的表達；在小鼠體內(nèi)具有調(diào)節(jié)系統(tǒng)及局部免疫能力的作用，糾正荷瘤小鼠淋巴細胞亞群的比例失調(diào)，增強局部淋巴細胞浸潤，抑制腫瘤生長，上調(diào)荷瘤小鼠Fas的表達，誘導