結(jié)核桿菌Ag85B-IL-2融合蛋白的原核表達(dá)、純化及其對(duì)膀胱腫瘤免疫治療效應(yīng)的研究.pdf

1、膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤,具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高等臨床特點(diǎn).膀胱粘膜局部免疫功能低下,是使殘存瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視、得以生存、發(fā)展形成復(fù)發(fā)的重要原因之一.如何提高膀胱腫瘤患者的免疫功能成為治療和預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵.BCG膀胱灌注是治療膀胱腫瘤和預(yù)防其復(fù)發(fā)最有效的方法之一,BCG聯(lián)合IL-2治療膀胱腫瘤具有更好的臨床療效,但無(wú)論是BCG還是IL-2在臨床治療膀胱癌均存在著劑量大、療程長(zhǎng)、毒副作用大等缺點(diǎn).因此,探討更為有效、安全的

2、免疫療法對(duì)膀胱腫瘤治療及預(yù)防復(fù)發(fā)具有重要意義.Ag85B是BCG、結(jié)核桿菌及其它分枝桿菌最主要的分泌蛋白,是BCG在體外和體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分,也是廣泛分布于結(jié)核桿菌以及其它非典型分枝桿菌中具有交叉反應(yīng)性的蛋白,能夠誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)烈的Th1免疫反應(yīng).利用分枝桿菌Ag85B的免疫原性,除可在制備預(yù)防結(jié)核的多肽疫苗和基因疫苗中發(fā)揮作用外,在膀胱腫瘤及其它腫瘤治療中的應(yīng)用研究近年來(lái)受到重視.本研究運(yùn)用基因重組技術(shù),將結(jié)核桿菌Ag85B基因

3、與人IL-2cDNA進(jìn)行連接,構(gòu)建Ag85B/IL-2融合基因,并進(jìn)行原核表達(dá)和純化,獲得Ag85B/IL-2融合蛋白,研究Ag85B/IL-2融合蛋白在體內(nèi)外對(duì)膀胱腫瘤的免疫治療效應(yīng),為其進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ).主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.結(jié)核桿菌Ag85B/IL-2融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和原核表達(dá)⑴ 首先采用PCR的方法,以質(zhì)粒pUC18/Ag85B為模板,擴(kuò)增結(jié)核桿菌Ag85B基因,通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI位點(diǎn)使其

4、定向插入到克隆載體pUC18中,命名為pUC-Ag85B.再以質(zhì)粒pCIIL-2為模板擴(kuò)增不含信號(hào)肽的人IL-2編碼基因,通過(guò)限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI位點(diǎn)使IL-2 cDNA定向克隆到pUC-Ag85B中,以編碼連接子(Linker)Gly<,4>Ser<,1>的堿基序列連接于Ag85B基因下游,構(gòu)建克隆質(zhì)粒pUC-Ag85B/IL-2,酶切鑒定和序列測(cè)定證實(shí)Ag85B/IL-2融合基因符合設(shè)計(jì)要求.⑵ 將Ag85B/IL-2融

5、合基因亞克隆入三種不同的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1、pThioHis、pBV220,構(gòu)建三種表達(dá)載體pGEX-Ag85B/IL-2、pTHio-Ag85B/IL-2和pBV-Ag85B/IL-2,限制性內(nèi)切酶切鑒定顯示構(gòu)建正確.將三種表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21、DH5α和Top10,成功構(gòu)建基因工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2、Top10/ pTHio-Ag85B/IL-2和DH5α/ pBV-Ag85B/IL-

6、2.⑶ IPTG誘導(dǎo)基因工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2和Top10/ pTHio-Ag85B/IL-2表達(dá),42℃溫控誘導(dǎo)DH5α/ pBV-Ag85B/IL-2表達(dá),SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果.結(jié)果顯示:工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2成功表達(dá)出大小約66kD的蛋白,與GST-Ag85B/IL-2融合蛋白理論大小近似,表達(dá)量占菌體總蛋白的31﹪.用兔抗人IL-2單克隆抗體行Western blot,

7、此蛋白條帶呈陽(yáng)性,間接證實(shí)了表達(dá)的蛋白為GST-Ag85B/IL-2融合蛋白.其余兩種基因工程菌未能表達(dá)出目的蛋白.⑷ 對(duì)GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化, 37℃ IPTG誘導(dǎo)下,融合蛋白的表達(dá)量在5~6h達(dá)高峰;0.1~1.5mmol/L IPTG濃度范圍內(nèi)融合蛋白表達(dá)量沒有明顯差異.故確定表達(dá)條件為0.1mmol/L IPTG,37℃,誘導(dǎo)時(shí)間5~6h.蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果顯示融合蛋白主要以包涵體形式產(chǎn)生.2.

8、Ag85B/IL-2融合蛋白的純化⑴ 大量表達(dá)并分離GST-Ag85B/IL-2融合蛋白包涵體,用8mol/L尿素溶解,并采用梯度濃度尿素對(duì)包涵體成功進(jìn)行透析復(fù)性.⑵ 將包涵體復(fù)性液上樣于GST-Sepharose 4B親和層析柱,以GSH洗脫液洗脫,收集主峰行SDS-PAGE電泳,結(jié)果證實(shí)主峰中含有初步純化的GST-Ag85B/IL-2融合蛋白,分子量約為66kD,與預(yù)期結(jié)果相符,但仍有部分雜蛋白,表明有部分蛋白發(fā)生了非特異性吸附.將

9、親和層析后的樣品溶液中加入凝血酶,室溫下作用5h,行SDS-PAGE電泳,結(jié)果證實(shí)融合蛋白大部分被切開,酶切后出現(xiàn)了66kD、45kD、26kD三條主要蛋白條帶. ⑶ 融合蛋白的凝血酶裂解產(chǎn)物上樣于Q Sepharpse Fast Flow層析柱行陰離子交換層析,收集主峰蛋白行SDS-PAGE電泳,結(jié)果證實(shí)主峰主要為切掉GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,分子量約為45kD,純度明顯提高,但仍有少量雜蛋白.⑷ 進(jìn)一步行RP-HPLC純

10、化獲得純度為98.32﹪的目的蛋白,N末端氨基酸序列測(cè)定與預(yù)期的Ag85B/IL-2融合蛋白完全一致.3.Ag85B/IL-2融合蛋白在體外對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)⑴ 利用CTLL-2株,MTT法檢測(cè)Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2比活性,結(jié)果為2500 u/mg.⑵ MTT法檢測(cè)Ag85B/IL-2融合蛋白對(duì)人PBMC增殖的影響,結(jié)果表明:當(dāng)Ag85B/IL-2融合蛋白刺激濃度小于0.8ug/ml時(shí),隨著刺激濃度的增加,PB

11、MC的增殖水平也增加,以0.8ug/ml濃度時(shí)作用72h時(shí)達(dá)最高,繼續(xù)增高刺激濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間,PBMC的增殖水平不再升高.⑶ ELISA法檢測(cè)Ag85B/IL-2融合蛋白作用PBMC后Th1型細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平,結(jié)果以0.8ug/ml的濃度刺激PBMC 72h時(shí),IL-12的分泌達(dá)最高;IFN-γ水平在各種濃度Ag85B/IL-2融合蛋白刺激后, 72h內(nèi)緩慢上升,72h后則快速上升,其中以1.6ug/ml的刺

12、激濃度作用96h時(shí),IFN-γ水平達(dá)最高.Ag85B/IL-2融合蛋白刺激PBMC 72時(shí), IL-12和IFN-γ分泌水平均顯著強(qiáng)于Ag85B、IL-2、Ag85B+IL-2和BCG.⑷ MTT法檢測(cè)Ag85B/IL-2融合蛋白激活的PBMC對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU-87、T24、E-J和BTT739的細(xì)胞毒作用.結(jié)果Ag85B/IL-2融合蛋白激活的PBMC 殺傷性細(xì)胞,對(duì)BIU-87、T24、E-J和BTT739均有一定的細(xì)胞毒作用

13、;當(dāng)效靶比大于20:1時(shí),對(duì)BIU-87、T24、E-J的細(xì)胞毒作用強(qiáng)于Ag85B、IL-2和BCG激活的殺傷性細(xì)胞;對(duì)BTT739的細(xì)胞毒作用強(qiáng)于Ag85B、IL-2、Ag85B+IL-2和BCG激活的殺傷性細(xì)胞.⑸ Ag85B/IL-2融合蛋白激活的PBMC 殺傷性細(xì)胞作用 BIU-87、T24、E-J和BTT739細(xì)胞后,靶細(xì)胞在光鏡和電鏡下均表現(xiàn)不同程度的損傷性形態(tài)改變.流式細(xì)胞儀測(cè)得靶細(xì)胞的凋亡水平均有上升.4.Ag85B/I

14、L-2融合蛋白對(duì)移植性小鼠膀胱腫瘤的抑瘤效應(yīng)⑴ 成功建立了BTT739膀胱腫瘤荷瘤小鼠模型.重組Ag85B/IL-2融合蛋白治療組的荷瘤鼠平均瘤重和平均體積均顯著低于Ag85B、IL-2、BCG、Ag85B+IL-2治療組和NS對(duì)照組重組;生存期顯著長(zhǎng)于Ag85B、IL-2、BCG 、Ag85B+IL-2治療組和NS對(duì)照組.⑵ Ag85B/IL-2融合蛋白治療后的膀胱腫瘤,光鏡下有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤細(xì)胞壞死、出血等;電鏡下可見細(xì)胞

15、膜破裂,細(xì)胞器破壞,胞漿固縮,核破壞,核染色質(zhì)聚集,凋亡小體出現(xiàn),巨噬細(xì)胞吞噬增多等.綜上所述,本研究采用基因工程技術(shù),通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)融合表達(dá)出Ag85B/IL-2融合蛋白,并對(duì)目的蛋白進(jìn)行了有效的分離、純化,經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步觀察,表明它可以促進(jìn)PBMC增殖并分泌Th1型細(xì)胞因子,其激活的免疫細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用;對(duì)移植性小鼠膀胱腫瘤具有抑瘤效應(yīng),并延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存期.本研究為開發(fā)治療膀胱腫瘤和預(yù)防其復(fù)發(fā)