熊果酸通過(guò)SIRT1-Atg5激活自噬對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：復(fù)制ox-LDL（100μg/ml）誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型，并從熊果酸通過(guò)Sirt1/Atg5上調(diào)自噬抵抗ox-LDL所致HUVECs氧化應(yīng)激的角度探討其保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：以體外培養(yǎng)的HUVECs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立細(xì)胞氧化損傷模型，并篩選出熊果酸最佳預(yù)保護(hù)時(shí)間及作用濃度。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常對(duì)照組，模型組，熊果酸組，模型+熊果酸組，模型+維生素E組、自噬抑制劑3-MA組及Sirt1抑制劑EX-527組。采用CCK

2、-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率；化學(xué)酶法檢測(cè)細(xì)胞H2O2、MDA、SOD、NO及NOS水平；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；ESR自旋捕捉技術(shù)同時(shí)定量檢測(cè)NO及ROS的釋放量；Western blotting檢測(cè)Sirt1、LC3B、p62、Atg5蛋白表達(dá)；免疫沉淀法檢測(cè)乙?；疉tg5蛋白。
　　結(jié)果：復(fù)制了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型；模型組細(xì)胞SOD、NOS、NO水平下降，MDA、H2O2含量增多；而加入5-20μM熊果酸

3、預(yù)保護(hù)16h后，細(xì)胞存活率、SOD、NOS、NO水平上升，MDA、H2O2產(chǎn)生減少，且呈劑量依賴(lài)性（P<0.05）。透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，正常組HUVECs細(xì)胞質(zhì)密度均勻，細(xì)胞器形態(tài)正常；模型組細(xì)胞質(zhì)濃縮，可見(jiàn)大量電子致密顆粒，偶見(jiàn)多層膜包繞的泡狀結(jié)構(gòu)；熊果酸組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。Western blotting結(jié)果表明，ox-LDL損傷24h對(duì)Sirt1、LC3B及p62蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P>0.05）；而單獨(dú)熊

4、果酸及熊果酸預(yù)保護(hù)16h的內(nèi)皮細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)上調(diào)，且均有LC3BⅡ/Ⅰ比值升高并伴隨p62蛋白水平的降低（P<0.05）。加入3-MA或EX-527預(yù)孵育2h后，細(xì)胞生存率與熊果酸預(yù)保護(hù)組相比明顯下降（P<0.01）。ESR結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞內(nèi)NO釋放量顯著下降伴隨ROS釋放量顯著增多，熊果酸預(yù)保護(hù)16h可逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，而3-MA或EX-527會(huì)減弱熊果酸的保護(hù)作用（P<0.05）。另外，EX-527會(huì)使熊果酸預(yù)保護(hù)組Sir

5、t1蛋白水平及LC3BⅡ/Ⅰ比例明顯下降，p62表達(dá)升高；免疫沉淀結(jié)果可見(jiàn)，熊果酸預(yù)保護(hù)16h后，HUVECs內(nèi)乙酰化Atg5蛋白表達(dá)量明顯減少，而加入EX-527后，對(duì)應(yīng)的乙?；疉tg5蛋白則相應(yīng)增多。
　　結(jié)論：100μg/ml的ox-LDL作用24h能夠誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生氧化損傷，而5-20μM熊果酸可呈劑量依賴(lài)性提高細(xì)胞生存率并改善細(xì)胞氧化應(yīng)激，建立了ESR自旋共振捕捉技術(shù)同時(shí)定量檢測(cè)HUVECs內(nèi)NO和ROS含量的方法