Egr-1和WT1優(yōu)勢(shì)結(jié)合TGF-β1在白血病細(xì)胞分化為單核-巨噬細(xì)胞過(guò)程中的作用.pdf

1、背景:
　　TGF-β/SMAD信號(hào)通路作為一種腫瘤抑制信號(hào)，在多種實(shí)體瘤中有降低或者異常表達(dá)，在白血病中也有異常表達(dá)。TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的組分突變失活或者其下游靶基因的表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致TGF-β/SMAD信號(hào)通路受阻，白血病細(xì)胞異常增殖，分化受阻。大量的證據(jù)表明，TGF-β/SMAD信號(hào)通路在TGF-β、維生素D及全反式維甲酸（ATRA）誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。
　　此外，上游的多種轉(zhuǎn)錄因子也可

2、以調(diào)節(jié)TGF-β/SMAD信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(Early growth response factor1，Egr-1)和Wilms腫瘤基因1(The Wilms' tumour1，WT1))等。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，Egr-1和WT1編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)中均含有相似的鋅指結(jié)構(gòu)域，二者具有廣泛的同源性。這些因子編碼的的蛋白與TGF-β1的啟動(dòng)子區(qū)域有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)結(jié)合到靶基因上相應(yīng)的DNA結(jié)合區(qū)域來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。P21是位于

3、P53基因下游的細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子，主要發(fā)揮抑癌的作用。研究表明:P21與腫瘤的分化有密切的關(guān)系。在白血病細(xì)胞中，P21處于低表達(dá)的水平，可能與其在轉(zhuǎn)錄及翻譯后水平的表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β可以介導(dǎo)P21的表達(dá)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF（Vascular endothelial growth factor）作為一種重要的促腫瘤血管生成因子，對(duì)造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致了白血病等惡性血液病的發(fā)生。在體外實(shí)驗(yàn)中

4、，VEGF促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。根據(jù)文獻(xiàn)中的報(bào)道，P21抑癌基因作為T(mén)GF-β/SMAD信號(hào)通路的靶點(diǎn)之一，與造血干細(xì)胞的自我更新有關(guān)，另外SMAD3蛋白可以特異性的結(jié)合到VEGF啟動(dòng)子區(qū)域(1006-954bp)，從而負(fù)向調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄。P21和VEGF均為T(mén)GF-β/SMAD信號(hào)通路下游的相關(guān)的靶基因，信號(hào)通過(guò)的變化必定會(huì)引起P21和VEGF的表達(dá)變化。
　　在以上背景材料下，我們的實(shí)驗(yàn)以TGF-β/SMAD信號(hào)

5、通路為切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)了相關(guān)的不同的實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究在不同類(lèi)型白血病細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，Egr-1和WT1對(duì)TGF-β1的調(diào)控作用及其對(duì)TGF-β/SMAD信號(hào)通路信號(hào)傳遞的影響。
　　目的:
　　以TGF-β/SMAD信號(hào)通路作為研究的切入點(diǎn)，探討佛波酯(PMA)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞方向分化后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1及其下游轉(zhuǎn)錄因子早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(Egr-1)和Wilms腫瘤基因1(WT1)的表達(dá)變化和

6、TGF-β/SMAD信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)情況，進(jìn)一步探討Egr-1和WT1是否可以通過(guò)調(diào)控TGF-β1來(lái)影響TGF-β/SMAD信號(hào)通路。
　　方法:
　　建立PMA誘導(dǎo)K562、HL-60、THP-1的白血病細(xì)胞分化的體外模型，采用CCK8法檢測(cè)不同的PMA的濃度在作用不同時(shí)間后對(duì)K562細(xì)胞的增殖的影響，并計(jì)算PMA作用于K562細(xì)胞72h后的半數(shù)抑制濃度(IC50)，應(yīng)用Wright-Gimesa染色觀察藥物作用于各白血病細(xì)

7、胞之后形態(tài)學(xué)上的變化，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化抗原CD11b、CD14的表達(dá)變化，并進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Egr-1、WT1及TGF-β/SMAD信號(hào)通路中相關(guān)因子如TGF-β1、SMAD3、SMAD4以及信號(hào)通路下游基因P21和VEGF在基因水平的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)用Western blot的方法檢測(cè)Egr-1、WT1和TGF-β1在蛋白水平的相對(duì)表達(dá)情況，用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)驗(yàn)證Egr-1

8、、WT1在藥物作用前后與TGF-β1的結(jié)合情況。
　　結(jié)果
　　不同濃度的PMA能抑制K562細(xì)胞的增殖并能促進(jìn)其分化，通過(guò)計(jì)算得出PMA作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為100 nm/L;在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，均出現(xiàn)相似的變化，細(xì)胞由懸浮狀態(tài)逐漸變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，細(xì)胞的體積明顯增大，細(xì)胞胞質(zhì)的褶皺增多，核質(zhì)比減少，呈現(xiàn)出向成熟的單核-巨噬細(xì)胞方向分化的趨勢(shì);細(xì)胞表面分化抗原CD11b、CD14的表達(dá)量升高;在mR

9、NA水平，TGF-β/SMAD信號(hào)通路中TGF-β、 SMAD3、SMAD4的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。在mRNA和蛋白水平，WT1的表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而Egr-1的表達(dá)先升高后降低，;信號(hào)通路下游基因的靶基因P21的表達(dá)量升高，而VEGF的表達(dá)量較對(duì)照組降低;CHIP實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在正常的白血病細(xì)胞中Egr-1與TGF-β1的啟動(dòng)子區(qū)域之間不結(jié)合，WT1結(jié)合于TGF-β1的啟動(dòng)子某一區(qū)域;而PMA作用于白血病細(xì)胞之后，Egr-1和WT1與TGF-

10、β1啟動(dòng)子的結(jié)合出現(xiàn)逆反，即藥物作用促使Egr-1結(jié)合于TGF-β1的啟動(dòng)子區(qū)域，而抑制了WT1與TGF-β1啟動(dòng)子某一位點(diǎn)的結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　在體外，PMA可以抑制白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞的增殖。PMA作用于各白血病細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)出向成熟的單核-巨噬細(xì)胞方向分化的趨勢(shì)，說(shuō)明PMA具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞系分化的作用，在此分化過(guò)程中，Egr-1可能是通過(guò)結(jié)合到TGF-β1的啟動(dòng)子區(qū)域，從而抑制了WT