耐喹諾酮類藥物鮑曼不動(dòng)桿菌PMQR基因及gyrA、parC基因突變的研究.pdf

1、背景：鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是一種非發(fā)酵,革蘭氏陰性,無(wú)動(dòng)力,氧化酶陰性桿菌,其廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和健康人體的皮膚表面,對(duì)濕熱、紫外線、化學(xué)消毒劑有較強(qiáng)抵抗力,可長(zhǎng)期存活,屬機(jī)會(huì)致病菌。近年來(lái),分離率逐年上升,在臨床各種標(biāo)本中,如血液,尿液、濃汁、下呼吸道分泌物以及腦脊液等都有分離出本菌的報(bào)道。根據(jù)美國(guó)院內(nèi)感染檢測(cè)數(shù)據(jù)(NNIS)及中國(guó)院內(nèi)感染病原菌耐藥監(jiān)測(cè)等資料顯示,鮑曼不動(dòng)桿菌

2、目前已成為僅次于銅綠假單胞菌的一個(gè)重要的非發(fā)酵菌,在院內(nèi)感染中占第四位,是醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌。喹諾酮類抗菌藥物是臨床最常用的抗菌藥物之一,隨著廣泛應(yīng)用,細(xì)菌對(duì)其耐藥性逐漸升高。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制包括：①染色體基因突變；②外膜孔蛋白改變；③藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)等。近年來(lái),發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR),使人們對(duì)細(xì)菌耐喹諾酮類藥物的機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。
　　 目的：⑴了解廣東省人民醫(yī)院院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床

3、分布情況和抗菌藥物耐藥情況。⑵了解廣東省人民醫(yī)院內(nèi)喹諾酮耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶基因gyrA、parC的突變情況及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、aac(6')-Ib—cr、qepA的流行狀況。⑶探討鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥機(jī)制。
　　 方法：①收集2008年1月-2009年9月期間分離自廣東省人民醫(yī)院的鮑曼不動(dòng)桿菌,共386株。②采用VITEK-32型全自動(dòng)細(xì)菌分析系

4、統(tǒng)對(duì)臨床收集的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行重新鑒定。③采用肉湯稀釋法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)菌對(duì)常用抗生素的最低抑菌濃度(minimalinhibitory concentrations,MIC),所有結(jié)果的解釋均執(zhí)行美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2009年版的標(biāo)準(zhǔn)。④根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成針對(duì)目的基因的引物序列,采用PCR技術(shù)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶gyrA、parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增,并對(duì)PCR擴(kuò)增

5、產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析,與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以確定其亞型、有無(wú)突變、突變位點(diǎn)及由此導(dǎo)致的氨基酸改變。
　　 結(jié)果：⑴細(xì)菌的臨床資料顯示,386株鮑曼不動(dòng)桿菌有196株來(lái)自監(jiān)護(hù)病房,占50.78％,呼吸道標(biāo)本(痰+支氣管沖洗液)占全部標(biāo)本類型的82％。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,386株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)下列抗菌藥物耐藥率分別為,環(huán)丙沙星65.8％,左氧氟沙星61.4％,慶大霉素62.95％,阿米卡星1.30％,亞胺培南36.01％,頭孢

6、吡肟46.89％,頭孢曲松63.73％,頭孢他啶62.18％,哌拉西林/他嘩巴坦38.08％,同時(shí)耐三種以上抗菌藥物的多重耐藥菌株占63.47％。⑵通過(guò)對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均耐藥和敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行g(shù)yrA與parC基因的QRDR區(qū)PCR擴(kuò)增,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)25株耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌有6株gyrA基因發(fā)生了編碼95位氨基酸的密碼子ACT→AAT的突變,導(dǎo)致編碼的氨基酸由蘇氨酸(Thr)突變?yōu)樘於０?Asn)；有12株143位氨

7、基酸由纈氨酸(Val)突變?yōu)楣劝彼?Glu),其中有6株同時(shí)發(fā)生了95位氨基酸Thr→Asn的突變。25株耐藥菌株的parC基因QRDR區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物全部發(fā)生了編碼80位氨基酸密碼子由TCG→TTG的單點(diǎn)突變,導(dǎo)致編碼的氨基酸由絲氨酸(Ser)突變?yōu)榱涟彼?Leu)。兩株敏感菌株未發(fā)生任何突變。⑶386株鮑曼不動(dòng)桿菌通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序共有1株細(xì)菌檢出qnrB基因,該菌株對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星表現(xiàn)為耐藥,其他質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrA