耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌耐藥機制研究.pdf

1、 目的 本研究擬通過對本院臨床分離的 40 株鮑曼不動桿菌耐藥譜進行分析,篩選出對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株,用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術檢測碳青霉烯酶耐藥基因,旨在闡明鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制,對指導臨床合理使用抗菌藥物,預防和控制碳青霉烯類耐藥菌株的流行提供科學依據(jù)。同時采用差異蛋白組學的方法,利用SELDI-TOF-MS技術檢測碳青霉烯類抗菌藥物耐藥和

2、敏感菌株蛋白指紋圖譜,結合聚類分析探索其用于查找碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株親緣性遠近的臨床價值。方法 1. 收集本院2011年1月~2012年12月臨床分離的鮑曼不動桿菌株。2.使用MicroScan WalkAway96 全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)鑒定,并通過儀器檢測其對妥布霉素、復方新諾明、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、加替沙星、亞胺培南、左

3、氧氟沙星等的最低抑菌濃度(MIC),分析其耐藥情況,篩選出對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的鮑曼不動桿菌。3.用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術檢測碳青霉烯類相關耐藥基因 IMP、VIM 、OXA-23、OXA-24、OXA-58,然后對 PCR 擴增陽性產(chǎn)物電泳并成像,對PCR擴增陽性的產(chǎn)物進行測序,把測序結果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行比對。4.對所有40株鮑曼不動桿菌菌株先破壞細菌提取蛋白質(zhì)

4、,再用SELDI-TOF-MS技術及Au蛋白芯片檢測細菌蛋白質(zhì)指紋圖譜。5. 用Biomarker Wizard 3.1 軟件進行分析獲得的細菌蛋白質(zhì)圖譜,篩選出碳青霉烯類抗菌耐藥和敏感鮑曼不動桿菌菌株相關差異表達蛋白,用SPSS 19.0對碳青霉烯類抗菌耐藥鮑曼不動桿菌進行聚類分析,追溯其臨床感染的親緣性。結果 1.分離本院臨床標本共獲得40株鮑曼不動桿菌。2.對40株臨床分離的鮑曼不動桿菌的耐藥譜進行分析,獲得對碳青霉烯類藥物耐藥鮑

5、曼不動桿菌22株,耐藥率為55%,這22株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物耐藥率為100%。3.在22株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因中,OXA-23 陽性有 16 株,陽性率為72.7%, OXA-58陽性有5株,陽性率為22.7%, VIM陽性有7株,陽性率為31.8%,1株同時攜帶OXA-23、OXA-58 和VIM基因,陽性率為4.5%, 3 株同時攜帶 OXA-23 和 OXA-58 基因,陽性率為13

6、.6%,7 株同時攜帶OXA-23和VIM基因,陽性率為31.8%；未檢測到基因OXA-24和IMP。OXA-23、OXA-58、VIM基因擴增陽性產(chǎn)物測序結果經(jīng)BLAST程序?qū)Ρ确治雠cNCBI的相應基因序列的同源性分別為99%、99%和97-99%。4. 通過SELDI-TOF-MS對結合在Au芯片上的鮑曼不動桿菌蛋白質(zhì)進行檢測,獲得所有鮑曼不動桿菌蛋白質(zhì)指紋圖,通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥和敏感的鮑曼不動桿菌菌株間蛋白質(zhì)譜的表達具

7、有顯著性差異(P<0.05)。5. 對碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌質(zhì)譜結果聚類分析,結果顯示碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌在院內(nèi)的分布以A型為主,B型次之。結論1. 鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率比較高,尤其亞胺培南為55%。其余常用 14 種抗菌藥物的耐藥率均在 70%以上。2. 碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌OXA-23基因陽性率為72.7%,說明攜帶OXA-23基因可能為鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因之一,另

8、外有 1株攜帶OXA-23、OXA-58 和VIM基因,3株攜帶OXA-23和OXA-58基因,7株攜帶OXA-23和VIM基因,說明多種耐藥基因的攜帶是鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物耐藥的重要原因。3. 碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌有特征性的蛋白質(zhì)指紋圖。經(jīng)過聚類分析顯示碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌的分布以A型為主,B型次之,A型分為A1和A2兩個亞型,并以A1為主,B型也分為B1,B2,并以B2為主。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的鮑曼不