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文檔簡介
1、近年來非發(fā)酵菌在臨床分離的致病菌中呈增加趨勢,其中最主要菌種為不動桿菌和銅綠假單胞菌,不動桿菌中又以鮑曼不動桿菌最為常見。不動桿菌為條件致病菌,廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體的皮膚表面。目前,鮑曼不動桿菌已成為繼大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌之后的重要臨床分離菌。 近幾年來,多重耐藥鮑曼不動桿菌已經(jīng)在全球各地出現(xiàn)播散,甚至造成了爆發(fā)流行,并且伴隨著耐藥性的不斷上升。世界各地相繼報(bào)道了多重耐藥鮑曼不動桿菌的流行:歐洲
2、、北美、阿根廷、巴西、中國大陸、中國臺灣、中國香港、日本、韓國,甚至偏遠(yuǎn)的西太平洋大西地島等。 碳青霉烯類抗生素對不動桿菌有較好的抗菌活性,是治療不動桿菌重癥感染的首選抗生素。近年來,有關(guān)碳青霉烯類抗生素耐藥不動桿菌已經(jīng)開始出現(xiàn)和流行。INSPEAR(the International Network for the Study and Prevention of Emerging Antimicrobial Resistanc
3、e)將不動桿菌中出現(xiàn)碳青霉烯類抗生素耐藥株稱之為全球性的標(biāo)志性事件,呼吁進(jìn)行正確的流行病學(xué)和微生物學(xué)干預(yù)。 碳青霉烯酶是指能夠水解至少一種碳青霉烯類抗生素的一類β-內(nèi)酰胺酶。包括Ambler分子分類的A、B、D類酶。不動桿菌屬中最主要的碳青霉烯酶是D類酶。D類酶目前報(bào)道按照氨基酸同源性可分為8組,在鮑曼不動桿菌中報(bào)道的主要4組是OXA-23組、OXA-24組、OXA-51組、OXA-58組。D類碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗生素的水解
4、活性較低,對其耐藥性的介導(dǎo)常合并外膜通透性的降低和/或外排泵的激活。而且,最近發(fā)現(xiàn)oxa-23-like和oxa-51-like基因上游存在插入序列ISAbal,而oxa-58基因與插入序列ISAba2、ISAba3相關(guān)。插入序列ISAba可能與OXA類碳青霉烯酶編碼基因的同源重組、基因轉(zhuǎn)移以及表達(dá)調(diào)控關(guān)系密切。近年來,一類特殊的16S rRNA甲基化酶被發(fā)現(xiàn)——它能保護(hù)細(xì)菌的16SrRNA也即氨基糖苷類抗生素的主要作用靶位,引起廣譜的
5、氨基糖苷類抗生素耐藥,并且可在人和動物的致病菌間傳播。armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA是從臨床感染株中發(fā)現(xiàn)的6種主要的16S rRNA甲基化酶基因,最近歐洲和日本學(xué)者先后在一系列臨床致病菌中發(fā)現(xiàn)該類基因,并且發(fā)現(xiàn)它們常位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上,可在體外接合到受體菌。 本研究收集了我國6個省市25家醫(yī)院的700株鮑曼不動桿菌,篩選到342株碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌,對這些菌株的同源性、碳青霉烯酶基因型
6、及其與插入序列ISAbal的關(guān)系、16Sr RNA甲基化酶基因的分布情況等進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究。 1.碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌的篩選及耐藥性研究 使用K-B法(紙片擴(kuò)散法)從700株鮑曼不動桿菌中篩選到了342株亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌。利用瓊脂稀釋法和Etest法測定342株CRAB對14種常用抗菌藥物的體外最低抑菌濃度。發(fā)現(xiàn)所有亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌對美羅培南耐藥,其中多粘菌素E耐藥率最低為10.8%,頭
7、孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦耐藥率分別為54.2%和68.0%,米諾環(huán)素耐藥率75.9%,其余抗菌藥物耐藥率均大于90.0%. 2.碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌同源性研究 利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對342株CRAB進(jìn)行了同源性研究。342株鮑曼不動桿菌菌株根據(jù)脈沖場凝膠電泳條帶分析發(fā)現(xiàn)其中303株屬于6個主要流行克隆株。其中A克隆共62株,分布在浙江、北京、重慶3個省市,并且在浙江播及7個城市的8家醫(yī)院;B
8、克隆32株,分布于杭州、上海、沈陽的3家醫(yī)院;C克隆有160株,分布于浙江和上海,播散到了浙江8個城市的12家醫(yī)院;D克隆有31株菌株,分布于浙江杭州和金華的3家醫(yī)院;屬于克隆E的10株菌株在廣州中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院流行;屬于克隆F的8株菌株在金華中心醫(yī)院流行。CRAB在我國呈嚴(yán)重的大范圍流行態(tài)勢,已經(jīng)出現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)的爆發(fā)流行、醫(yī)院間甚至城市間的播散。需要采取切實(shí)有效的措施及時進(jìn)行干預(yù)。 3.碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌碳青
9、霉烯酶基因型及其與插入序列ISAbal關(guān)系研究 利用超聲破碎法提取β-內(nèi)酰胺酶粗提物,三維實(shí)驗(yàn)、等電點(diǎn)測定、雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn),檢測CRAB所產(chǎn)碳青霉烯酶:利用PCR檢測碳青霉烯酶基因、序列分析明確碳青霉烯酶基因型;利用重疊PCR研究oxa基因與插入序列ISAbal的關(guān)系;接合實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒抽提、電轉(zhuǎn)化、Southern雜交等明確碳青霉烯酶基因定位。342株碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌全部攜帶oxa-66基因,其中13株的oxa-6
10、6基因上游7bp處檢測到插入序列ISAbal。322株CRAB菌株攜帶oxa-23基因,其中314株菌株oxa-23基因上游34bp處檢測到插入序列ISAbal。ISAbal-oxa-23、ISAbal-oxa-66已在Genbank登錄,登錄號分別為:DQ923478、DQ923479。342株菌株中未檢測到金屬酶(IMP、VIM、SIM-1)基因,未檢測到oxa-24組和oxa-58組D類碳青霉烯酶基因。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生
11、素的耐藥性不能通過接合、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移到受體大腸埃希菌,質(zhì)粒抽提也未成功。Southern雜交提示oxa-23基因極可能位于菌株染色體上。研究證明,我國CRAB最主要的碳青霉烯酶基因型是oxa-23、oxa-66:插入序列ISAbal與oxa基因關(guān)系密切,在介導(dǎo)我國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥中起重要作用。 4.碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌16s rRNA甲基化酶基因分布研究 瓊脂稀釋法測定342株CRAB對5
12、種氨基糖苷類抗生素的MIC值,PCR篩選6種16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA,克隆測序明確基因型;接合試驗(yàn)、質(zhì)粒抽提、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),以及Southern雜交確定armA基因定位。342株碳青霉烯類抗生素對妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、異帕米星、奈替米星5種氨基糖苷類抗生素全部耐藥菌株287株,其中221株檢出armA基因;未發(fā)現(xiàn)rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA基因陽性菌株
13、。armA基因陽性菌株P(guān)FGE分型以A、B、C 3型為主。堿裂解法反復(fù)抽提未得到質(zhì)粒,多次接合、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)未成功;Southern雜交顯示armA基因分別位于克隆A、B、C菌株染色體ApaI酶切脈沖場凝膠電泳約220kb、300kb、220kb大小的DNA片斷上。16S rRNA甲基化酶基因armA在我國CRAB中廣泛存在,armA陽性菌株以克隆播散形式廣泛流行。armA基因定位于鮑曼不動桿菌的染色體上。 以上研究表明:
14、1、我國CRAB對各類抗菌藥物耐藥率高,多粘菌素E耐藥率最低為10.8%,頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒馬坦耐藥率分別為54.2%和68.0%.臨床可以根據(jù)藥敏結(jié)果選用含舒巴坦制劑,必要時可在嚴(yán)密監(jiān)測腎功能的情下考慮多粘菌素E治療; 2、CRAB在我國呈大范圍流行態(tài)勢,CRAB主要以克隆播散傳播,已經(jīng)出現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)的爆發(fā)流行、醫(yī)院間甚至城市間的播散。需要采取切實(shí)有效的措施及時進(jìn)行干預(yù)。 3、我國CRAB最主要的碳青霉烯酶基
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