體外氣道感染模型的建立及四維成像技術(shù)在巨噬細(xì)胞跨膜遷移和吞噬研究中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　肺部感染是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病。病原菌除了直接損傷機(jī)體引起疾病外，還可能引起其他疾病的發(fā)生，如有研究就認(rèn)為支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展可能與金黃色葡萄球菌有關(guān)。粘附于氣道表面粘液層的病原菌大部分通過(guò)咳嗽咳痰予以清除。氣道及肺泡巨噬細(xì)胞是肺部主要的吞噬細(xì)胞，他們能清除定植于肺泡和氣道表面的少量細(xì)菌及外源性灰塵顆粒。當(dāng)大量的病原菌感染氣道時(shí)，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的巨噬細(xì)胞便被招募到感染部位以清除病原菌。招募的單核巨噬細(xì)

2、胞通過(guò)氣道粘膜屏障（上皮細(xì)胞基底膜和上皮細(xì)胞層）而到達(dá)氣道表面,目前這一過(guò)程還缺少動(dòng)態(tài)形態(tài)學(xué)資料的支持。獲取這種細(xì)胞活動(dòng)的動(dòng)態(tài)學(xué)資料的最佳方法是在活體動(dòng)物上直接動(dòng)態(tài)觀(guān)察細(xì)胞的活動(dòng)。然而，立體動(dòng)態(tài)的細(xì)胞活動(dòng)在活體動(dòng)物身上獲取是非常困難的。因此，模擬組織的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型就顯得尤為重要。但是單一的細(xì)胞層及多細(xì)胞層的靜態(tài)研究無(wú)法用于巨噬細(xì)胞跨膜遷移的研究。因此我們將多細(xì)胞層的三維培養(yǎng)技術(shù)和激光共聚焦活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像結(jié)合起來(lái)，用來(lái)研究氣道感染模型

3、中巨噬細(xì)胞的跨膜遷移及對(duì)金葡菌的清除。
　　研究目的：
　　1.建立模擬氣道感染的體外多細(xì)胞層三維培養(yǎng)模型，在體外模擬肺內(nèi)部環(huán)境，更直觀(guān)精確的觀(guān)察細(xì)胞和細(xì)胞間相互作用以及信號(hào)通路的關(guān)系。
　　2.將多細(xì)胞層三維培養(yǎng)技術(shù)和激光共聚焦活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像結(jié)合起來(lái)形成四維成像技術(shù)，并用四維成像技術(shù)研究氣道感染模型中巨噬細(xì)胞的跨膜遷移及對(duì)金葡菌的清除。
　　研究方法：
　　1.巨噬細(xì)胞的分離及純化；
　　1％淀粉溶

4、液1ml連續(xù)腹腔注射小鼠3天，第五天對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔灌洗并對(duì)灌洗液進(jìn)行離心洗滌后，并用貼壁法對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行純化。
　　2.體外氣道感染模型的建立；
　　將LLC細(xì)胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，五天后待其形成完整細(xì)胞層后，將巨噬細(xì)胞種植于PET膜的下層，最后將金葡菌種植于LLC細(xì)胞層上。
　　3.跨膜電阻的測(cè)量；
　　將LLC細(xì)胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，并分別于第五天、第六天及加入金葡菌后第1、2、3

5、、4、5、6小時(shí)用電壓電阻儀測(cè)量LLC細(xì)胞層兩側(cè)的電阻。
　　4.巨噬細(xì)胞跨膜遷移運(yùn)動(dòng)的激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像:
　　氣道感染模型建立后并用紅色熒光染料標(biāo)記LLC細(xì)胞，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細(xì)胞皿，于激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行在Z軸（三維）及T軸（時(shí)間序列）成像。
　　5.金葡菌或MCP-1對(duì)巨噬細(xì)胞跨膜遷移的影響評(píng)估；
　　建立加金葡菌或MCP-1的實(shí)驗(yàn)組氣道模型和無(wú)金葡菌的對(duì)照組氣道模型，并在加入金葡菌/MCP

6、-16小時(shí)后于激光共聚焦顯微鏡上三維成像并計(jì)算穿膜率。
　　6. ELISA檢測(cè)MCP-1水平；
　　將LLC細(xì)胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，第五天實(shí)驗(yàn)組加入108級(jí)金葡菌于插入式培養(yǎng)皿的上室。3小時(shí)后收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（無(wú)金葡菌）的上室及下室的培養(yǎng)基。ELISA檢測(cè)實(shí)培養(yǎng)基中MCP-1的水平。
　　7.逆向跨膜遷移的激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像；
　　將LLC細(xì)胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，第五天加入巨

7、噬細(xì)胞于插入式培養(yǎng)皿的上室，并在插入式培養(yǎng)皿的下室加入小鼠重組 MCP-1。將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細(xì)胞皿于激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行在Z軸（三維）及T軸（時(shí)間序列）成像。
　　8.巨噬細(xì)胞在氣道感染模型中吞噬金葡菌的激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像；
　　氣道感染模型建立后并用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記 LLC細(xì)胞及紅色熒光染料標(biāo)記金葡菌，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細(xì)胞皿，于激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行在Z軸（三維）及T軸（時(shí)間序列）成像。
　　9.

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0軟件；數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；巨噬細(xì)胞的高度用單側(cè)t’檢驗(yàn)，其他用兩組間的獨(dú)立t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有顯著性。
　　研究結(jié)果：
　　1. LLC細(xì)胞形成完整細(xì)胞層；
　　將0.5 x106個(gè)LLC細(xì)胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，胞數(shù)從24時(shí)的1061±97個(gè)/mm2逐步增加到120小時(shí)的4954±256個(gè)/mm2。細(xì)胞覆蓋的表面積從24小時(shí)的27.3±6.0%，

9、逐步增加到120小時(shí)的99.8±0.3%。LLC細(xì)胞基本能形成完整的單細(xì)胞層的時(shí)間大約為5天。
　　2.金葡菌對(duì)LLC細(xì)胞層的完整性無(wú)明顯影響；
　　我們檢測(cè)了加入金葡菌前后插入式培養(yǎng)皿PET膜兩側(cè)的跨上皮電阻抗的變化。我們發(fā)現(xiàn)加入金葡菌后6小時(shí)內(nèi)，無(wú)論107級(jí)和108級(jí)的金葡菌對(duì)跨上皮電阻均無(wú)明顯影響。
　　3.動(dòng)態(tài)觀(guān)察氣道感染模型中巨噬細(xì)胞的跨膜遷移；
　　氣道感染模型建立后通過(guò)激光共聚焦四維成像及 IMAR

10、IS軟件三維重建，其結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞通過(guò)PET膜上的小孔遷移至培養(yǎng)體系的上室。
　　4.培養(yǎng)體系中加入金葡菌增加了巨噬細(xì)胞的跨膜遷移；
　　通過(guò)激光共聚焦四維成像及 IMARIS7.0.三維重建，發(fā)現(xiàn)一些巨噬細(xì)胞可以通過(guò)PET膜上的小孔遷移到插入式培養(yǎng)皿的上層；感染模型組中巨噬細(xì)胞的穿膜率顯著高于對(duì)照組。
　　5.培養(yǎng)體系中加入金葡菌增加了MCP-1趨化因子的表達(dá)；
　　我們檢測(cè)了加入金葡菌的實(shí)驗(yàn)組和無(wú)金葡菌的對(duì)

11、照組中MCP-1的水平差異。在實(shí)驗(yàn)組加入金葡菌3小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組的MCP-1水平明顯高于對(duì)照組。
　　6.培養(yǎng)體系中加入小鼠重組MCP-1增加了巨噬細(xì)胞的跨膜遷移；
　　將重組的小鼠MCP-120ng/ml加入實(shí)驗(yàn)組的插入式培養(yǎng)皿的上室。六小時(shí)過(guò)后，實(shí)驗(yàn)組的巨噬細(xì)胞穿膜率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。
　　7.培養(yǎng)體系中加入金葡菌影響巨噬細(xì)胞在上皮細(xì)胞層中的運(yùn)動(dòng)方式；
　　通過(guò)激光共聚焦四維成像及 IMARIS7.0.三維重建和

12、巨噬細(xì)胞示蹤，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在插入式培養(yǎng)皿上層主要有三種運(yùn)動(dòng)方式。與不加金葡菌的對(duì)照組相比，培養(yǎng)體系中加入金葡菌對(duì)巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)方式有影響。另外，在未加入金葡菌的對(duì)照組，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞穿過(guò)LLC單層細(xì)胞層并到達(dá)LLC單層細(xì)胞層的表面。
　　8.巨噬細(xì)胞從上向下跨膜遷移的動(dòng)態(tài)觀(guān)察；
　　氣道感染模型的四維成像顯示有巨噬細(xì)胞從上層通過(guò)PET膜遷移到培養(yǎng)體系的下層。將巨噬細(xì)胞種植在LLC單細(xì)胞層的表面，并且加入20ng/ml的

13、小鼠重組MCP-1于培養(yǎng)體系的下層，有更多的巨噬細(xì)胞從培養(yǎng)體系上層遷移到下層。
　　9.巨噬細(xì)胞在氣道感染模型中對(duì)金葡菌的吞噬具有時(shí)間依賴(lài)性；
　　氣道感染模型的四維成像顯示，定植于LLC單細(xì)胞層表面的金葡菌粘附于露出于LLC單細(xì)胞層的巨噬細(xì)胞，隨后巨噬細(xì)胞被吞噬。隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的巨噬細(xì)胞吞噬了金葡菌，平均每個(gè)巨噬細(xì)胞也吞噬了越來(lái)越多的金葡菌。
　　研究結(jié)論：
　　1.依據(jù)氣道感染時(shí)的病理結(jié)構(gòu)，我們成功