火雞組織滴蟲體外分離培養(yǎng)體系和動(dòng)物感染模型的建立及中藥體外抑制研究.pdf

1、禽組織滴蟲病(Histomoniasis)又稱為傳染性盲腸肝炎或“黑頭病”，是由火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）引起的雞形目禽類的一種原生寄生蟲病，以肝臟壞死、盲腸腫大和排硫磺樣糞便為主要特征，在火雞中尤為嚴(yán)重，可引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，由于能夠有效治療和預(yù)防該病的化學(xué)藥物具有潛在的致癌性而大多被禁止使用，導(dǎo)致該病近年發(fā)生大規(guī)模傳播和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。近年來，隨著國(guó)內(nèi)規(guī)?；鷳B(tài)圈養(yǎng)和放養(yǎng)等健康

2、養(yǎng)殖技術(shù)的示范和推廣，組織滴蟲病在我國(guó)的流行和發(fā)生也越來越嚴(yán)重，而國(guó)內(nèi)對(duì)相關(guān)研究并不多且不系統(tǒng)，因此，開展對(duì)火雞組織滴蟲及組織滴蟲病的研究，研究該病的發(fā)病機(jī)制、藥物防治及疫苗對(duì)于養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究首先對(duì)江蘇地區(qū)的火雞組織滴蟲進(jìn)行了分離，成功建立了火雞組織滴蟲體外分離培養(yǎng)的體系，并對(duì)該體系進(jìn)行了優(yōu)化;其次對(duì)分離的火雞組織滴蟲蟲體進(jìn)行單克隆培養(yǎng)并對(duì)純化的蟲株進(jìn)行了凍存和復(fù)蘇;用單克隆培養(yǎng)的蟲體成功建立了動(dòng)物感染模型;在體外

3、研究了中藥產(chǎn)品對(duì)火雞組織滴蟲的抑制作用。
　　1.火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)方法的建立
　　為了研究火雞組織滴蟲的生物學(xué)特性，建立一種簡(jiǎn)單有效的火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)方法非常重要?；痣u組織滴蟲感染的主要器官是盲腸和肝臟，是一種非常脆弱的微生物，在臟器中和環(huán)境溫度中裸露的蟲體一旦隨著糞便排出體外，只能夠存活很短的時(shí)間，所以火雞組織滴蟲的體外分離非常困難。本研究采用M199培養(yǎng)基可作為火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，再加入胎牛血清或者

4、滅活馬血清以及米粉等組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別從盲腸和肝臟中分離蟲體。將臨床上剪碎的肝臟組織或盲腸內(nèi)容物接種培養(yǎng)48 h后，首先對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行形態(tài)學(xué)判定，再經(jīng)PCR鑒定。研究結(jié)果表明，用盲腸內(nèi)容物分離培養(yǎng)時(shí)得到3種盲腸寄生原蟲:火雞組織滴蟲，芽囊原蟲和雞四毛滴蟲，三者混合感染，難以獲得單一種類蟲體;從肝臟中分離時(shí)能獲得單一種類的火雞組織滴蟲蟲體，火雞組織滴蟲的體外分離培養(yǎng)宜從帶有病變的新鮮肝臟組織中進(jìn)行。
　　2.火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)體

5、系的優(yōu)化
　　火雞組織滴蟲培養(yǎng)基包含M199培養(yǎng)基、米粉、滅活馬血清及盲腸細(xì)菌，為建立最優(yōu)的培養(yǎng)體系，本研究對(duì)培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液的組成進(jìn)行了系列優(yōu)化。在40℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2-3天后火雞組織滴蟲的群體數(shù)量將會(huì)達(dá)到5×105個(gè)/ml，隨后便會(huì)開始快速減少。實(shí)驗(yàn)過程中改變每9 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中米粉的量0 mg,10 mg、20 mg、40 mg,60 mg,80 mg,100 mg;血清的種類:胎牛血清與滅活馬血清;血清比例0、5

6、％、10％、15％、20％、30％、40％;以及有氧與無氧培養(yǎng)條件的比較。再利用新鮮的病變肝臟組織進(jìn)行火雞組織滴蟲分離培養(yǎng)，比較有盲腸細(xì)菌和無盲腸細(xì)菌的差別，最終獲得了火雞組織滴蟲的最佳體外培養(yǎng)體系。火雞組織滴蟲在9 ml含90％ M199培養(yǎng)基，10％滅活馬血清，10 mg米粉及含盲腸細(xì)菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，可培養(yǎng)獲得穩(wěn)定和高產(chǎn)量的火雞組織滴蟲蟲體。
　　3.火雞組織滴蟲的體外單克隆及保存復(fù)蘇
　　采用體外分離培養(yǎng)技術(shù)

7、對(duì)江蘇地區(qū)采集的兩例典型病變的新鮮肝臟組織中火雞組織滴蟲進(jìn)行了體外分離培養(yǎng)，獲得了兩個(gè)不同地區(qū)火雞組織滴蟲的蟲體。進(jìn)一步參照球蟲單卵囊分離技術(shù)中的懸液法對(duì)火雞組織滴蟲進(jìn)行了單克隆純化，獲得兩株火雞組織滴蟲，分別命名為JSYZ-A和JSYZ-B。然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的單克隆蟲株放入液氮中長(zhǎng)期凍存，并且對(duì)凍存的蟲株成功進(jìn)行了復(fù)蘇。研究結(jié)果表明，建立的火雞組織滴蟲體外單克隆培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇的方法切實(shí)可行，為開展蟲體的病原學(xué)、致病機(jī)理以及燕窩和疫苗的

8、研制奠定了很好的基礎(chǔ)。
　　4.火雞組織滴蟲體外動(dòng)物感染模型的建立
　　采用單克隆培養(yǎng)的火雞組織滴蟲JSYZ-A感染了SPF黃羽雞。研究了不同感染劑量、不同感染途徑對(duì)火雞組織滴蟲體外感染動(dòng)物模型的影響。實(shí)驗(yàn)中用JSYZ-A蟲株以104、105和106個(gè)蟲體經(jīng)口感染3組15日齡的黃羽雞;再經(jīng)泄殖腔以104、105和106個(gè)蟲體感染3組15日齡的黃羽雞;并設(shè)對(duì)照組，每組10只雞。感染15天后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)雞的死亡率、平均增重、盲腸

9、和肝臟的損傷等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)人工感染的效果。研究結(jié)果表明，黃羽雞經(jīng)泄殖腔感染105個(gè)蟲體時(shí)就可以成功建立火雞組織滴蟲的體外感染動(dòng)物模型。
　　5.不同中草藥對(duì)火雞組織滴蟲體外抑制效果的研究
　　出于食品安全方面的考慮，能夠有效預(yù)防和治療禽組織滴蟲病的化學(xué)藥物都被禁止使用，這使得禽組織滴蟲病在禽養(yǎng)殖業(yè)中大量爆發(fā)，帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失，迫切需要尋找一種能夠替代化學(xué)藥物且能有效控制禽組織滴蟲病的藥物。本實(shí)驗(yàn)比較了白頭翁、金蓮花、

10、雞冠花、荊芥、常山、香薷、花椒、駱駝蓬、苦參、千里光、大蒜素、青蒿素、蛇床子素13種中草藥及提取物在體外對(duì)火雞組織滴蟲的抑制作用。將藥物加入到預(yù)準(zhǔn)備M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基中后，然后再接種火雞組織滴蟲進(jìn)行培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時(shí)間觀察計(jì)數(shù)蟲體的生長(zhǎng)繁殖狀況，得到藥物對(duì)體外培養(yǎng)的火雞組織滴蟲的抑制效果，所選白頭翁、金蓮花、雞冠花等10種中草藥在體外對(duì)火雞組織滴蟲有較好的抑制作用，其中以金蓮花、常山和駱駝蓬的抑制作用最好;大蒜素、青蒿素等3種中草藥提取