鼠椎間盤環(huán)狀纖維細胞永生化及誘導(dǎo)分化研究和小鼠椎間盤組織體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、椎間盤退變（DDD）是造成下腰痛的主要原因。近年來組織工程學技術(shù)的飛速發(fā)展為治療DDD提供了新的思路和方法。作為維持內(nèi)部密閉環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)，環(huán)狀纖維細胞由于其特殊的生物化學屬性、復(fù)雜的微觀結(jié)構(gòu)和生物力學性質(zhì)，一直是椎間盤重建組織工程學領(lǐng)域的重大題挑戰(zhàn)。尋找具有再生能力的種子細胞是椎間盤組織工程重建中最重要的工作之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子β(Transform

2、ing Growth Factorβ，TGFβ)超家族的成員，在調(diào)節(jié)干細胞增殖分化中起著重要的作用。BMPs除了能夠誘導(dǎo)成骨分化外，很可能在維持椎間盤細胞活性，修復(fù)內(nèi)源性和外源性損傷中起著比較重要的作用。
　　本實驗通過 BMP9刺激椎間盤環(huán)狀纖維細胞，研究在其誘導(dǎo)下椎間盤環(huán)狀纖維細胞分化的能力。本研究的目的在于①建立椎間盤環(huán)狀纖維細胞分離培養(yǎng)的方法②建立穩(wěn)定的可逆化小鼠環(huán)狀纖維細胞系③研究 BMP9對椎間盤環(huán)狀細胞的生物學效應(yīng)④

3、證實永生化后終末分化細胞向另一種終末分化細胞轉(zhuǎn)分化的能力。
　　的椎間盤是一個器官有多種細胞和組織組成。單純孤立的研究某一種細胞對于椎間盤的研究來說缺乏全面性和系統(tǒng)性。動物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜可變因素繁多也不利于早中期實驗研究。因此我們需要一個介于體外細胞培養(yǎng)和動物體內(nèi)實驗的過度實驗平臺。因此本研究另一個目的是建立并完善基于小鼠種屬來源的椎間盤組織體外培養(yǎng)體系。本實驗分為三個部分
　　第一部分小鼠椎間盤原代細胞的分離、培養(yǎng)及永生化<

4、br>　　目的：分離培養(yǎng)并永生化鑒定小鼠椎間盤環(huán)狀纖維細胞
　　方法：①顯微操作分離小鼠椎間盤環(huán)狀纖維組織②培養(yǎng)原代椎間盤細胞③利用piggyBac系統(tǒng)將SV40大T抗原導(dǎo)入原代細胞中④通過潮霉素篩選，最終獲得永生化細胞系⑤Flp條件敲除SV40大T抗原片段，驗證永生化的可逆性。
　　結(jié)果：細胞增殖實驗顯示永生化以后的細胞增殖能力大大增強；流式細胞計數(shù)顯示永生化以后處在 G2/M期的細胞明顯減少；敲除SV40大T抗原后，細胞

5、喪失無限增殖能力；qPCR顯示相關(guān)特異細胞表面標志表達顯著升高；特異性免疫熒光染色成陽性。
　　結(jié)論：①獲得椎間盤環(huán)狀纖維細胞②獲得具有無限增殖能力的鼠來源可逆永生化環(huán)狀纖維細胞。
　　第二部分利用BMP9誘導(dǎo)永生化椎間盤環(huán)狀纖維細胞，觀察其增殖和誘導(dǎo)分化情況
　　目的：觀察BMP9誘導(dǎo)分化永生化小鼠椎間盤環(huán)狀纖維細胞的情況。
　　方法：①利用重組腺病毒 Ad-BMP9將 BMP9導(dǎo)入 iAF細胞。Ad-GFP作

6、為對照組②通過ALP染色和ALP讀數(shù)檢測早期成骨指標的變化③通過OPN/OCN和Alizarin red檢測晚期成骨指標④通過Oil red染色檢測成脂分化④將感染BMP9腺病毒的iAF細胞植入裸鼠皮下觀察成瘤和成骨情況⑤在組織切片水平進一步分析BMP9對iAF誘導(dǎo)分化的影響。
　　結(jié)果：①ALP讀數(shù)明顯增高和染色呈強陽性②OPN/OCN表達明顯增高③細胞裸鼠皮下移植有骨性包塊形成④Oil red o染色呈弱陽性
　　結(jié)論：

7、①iAF細胞在 BMP9誘導(dǎo)下具有向成骨方向分化的能力②iAF細胞在 BMP9誘導(dǎo)下具有一定的成脂分化能力③BMP9能夠促進iAF細胞外基質(zhì)分分泌
　　第三部分建立鼠來源椎間盤組織體外培養(yǎng)體系
　　目的：建立小鼠椎間盤體外培養(yǎng)模型，完善相關(guān)操作技術(shù)和檢查方法。
　　方法：①建立解剖分離椎間盤組織的操作方法②觀察不同培養(yǎng)基中椎間盤組織的生存情況③觀察不同培養(yǎng)裝置中椎間盤組織的生存情況④驗證病毒基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)在該模型中使用的

8、可行性⑤觀察 BMP9腺病毒對體外培養(yǎng)的椎間盤組織的生物學影響。
　　結(jié)果：①完整分離椎間盤組織②在10％FBS DMEM培養(yǎng)基中椎間盤組織能夠存活14天以上③重組腺病毒能夠感染椎間盤組織④Ad-BMP9能夠感染椎間盤組織。
　　結(jié)論：①建立小鼠椎間盤組織分離的操作流程②尋找到一個相對理想的培養(yǎng)條件③腺病毒能夠感染體外培養(yǎng)的椎間盤組織并發(fā)揮生物學效力
　　總結(jié)：本實驗首次分離鑒定了小鼠來源的椎間盤環(huán)狀纖維組織。利用BM