大鼠脫細胞腎臟骨架的構(gòu)建及細胞相容性檢測.pdf

1、背景:目前,慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的發(fā)病率逐年增加,進入CKD終末期的患者數(shù)量也在上升。透析和腎移植是目前主要的替代治療方式,而腎移植是最有效和理想的治療模式,但它的前提是必須有充分的器官來源,而我們國家器官短缺的問題非常突出。此外,異體移植的腎臟在宿主體內(nèi)會受到免疫系統(tǒng)的攻擊,腎臟移植患者需長期口服免疫抑制劑以避免排異反應,但藥物的副作用也是眾所周知的。近年來組織工程的發(fā)展使再生器官作為移

2、植器官的來源成為可能。良好的組織工程材料是器官再生的關鍵,但由于腎臟結(jié)構(gòu)非常復雜,目前人工合成材料無法構(gòu)建如此復雜的結(jié)構(gòu)。器官脫細胞的方法的出現(xiàn)使無細胞成分的器官骨架作為器官再生的組織工程材料成為可能。脫細胞的腎臟骨架保留了腎臟的復雜結(jié)構(gòu),而且其細胞外基質(zhì)成分中有誘導細胞定植與分化的信號,這些因素都有利于腎臟再生。目前國外已有一些器官細胞洗脫方面的研究,但國內(nèi)這方面的研究還很少。
　　目的:利用細胞洗脫的方法構(gòu)建無細胞成分的腎臟骨

3、架;對骨架的微觀結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)成分進行檢測和鑒定;檢測脫細胞腎臟骨架對多種細胞的毒性;觀察大鼠誘導多能干細胞在脫細胞腎臟骨架中的存活情況。
　　方法:(1)取出帶有動靜脈通路的腎臟,通過動脈向腎臟內(nèi)持續(xù)依次灌注1％的十二烷基磺酸鈉(sodium dodecylsulfatesodium salt,SDS)溶液和1%的Triton-X100溶液,在多個時間點觀察腎臟形態(tài)和顏色的變化,并利用蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin

4、and Eosin stain,HE)觀察是否有細胞成分殘留,腎臟骨架結(jié)構(gòu)是否完整;電鏡觀察腎臟骨架的超微結(jié)構(gòu);并用免疫組化及過碘酸-希夫氏染色(Periodic Acid-Schiff stain)的方法檢測腎臟骨架細胞外基質(zhì)成分的保留情況。
　　(2)利用浸泡過脫細胞腎臟骨架的培養(yǎng)基(脫細胞腎臟骨架浸提液)處理大鼠腎臟系膜細胞系、大鼠成纖維細胞系49F細胞、人腎小管上皮細胞系HK-2細胞、小鼠條件永生化足細胞系(MPC5),用

5、MTT實驗檢測細胞的增殖能力,用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率和壞死率。
　　(3)培養(yǎng)大鼠的誘導多能干細胞,收集1×107數(shù)量的細胞,通過脫細胞腎臟骨架的動脈灌注到腎臟骨架中培養(yǎng),觀察大鼠誘導多能干細胞在骨架中的存活情況。
　　結(jié)果:(1)依次用1%的SDS溶液灌注12h,1%的Triton-X100溶液灌注30min后,腎臟變?yōu)榘咨胪该鳡?HE染色顯示脫細胞腎臟骨架無細胞成分殘留,重要的細胞外基質(zhì)成分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、

6、彈性蛋白、糖蛋白都得到保留,電鏡顯示脫細胞腎臟骨架內(nèi)無明顯細胞成分殘留,基底膜連續(xù)完整,系膜基質(zhì)也得到保留。
　　(2)MTT實驗結(jié)果顯示腎臟骨架浸提液處理過的大鼠腎臟系膜細胞、49F細胞、HK-2細胞增殖能力與對照組無明顯差異;流式細胞儀檢測浸提液處理后細胞的凋亡率和壞死率與對照組也無明顯差異。
　　(3)大鼠脫細胞腎臟骨架內(nèi)有iPSCs存活。
　　結(jié)論:(1)利用1%SDS溶液和1%Triton-X100溶液能成功